猪葡萄球菌多重pcr检测方法的建立与zlt-1株的蛋白全谱分析

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1、分类号S859.7学校代码10129UDC11.220学号2009201072猪葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与ZLT-1株的蛋白全谱分析EstablishmentofamultiplexPCRassayfordetectionofStaphylococcushyicusandProteomicAnalysisofZLT-1strain申请人：陈亚强学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物与免疫学指导教师：郝永清教授宋长绪研究员论文提交日期：二〇一二年六月摘要猪葡萄球菌是一种环境常见菌，也是仔猪渗出性皮炎的主要病原。本研究根据GenBank已发表的猪葡萄球菌

2、的6种脱落毒素基因序列，设计合成了6对特异性引物，通过特异性、敏感性和重复性试验建立了可行的猪葡萄球菌及脱落毒素的多重PCR检测方法。对临床分离到的9株猪葡萄球菌的检测结果显示，均扩增出了与预期大小相符的23SrDNA（662bp）条带；同时，其中6株扩增出了ExhA（316bp，2株）、ExhC（525bp，2株）和ShetA（814bp，2株）基因特异性条带；另外3株均未扩增出任何毒素基因条带，鉴定为无毒力型菌株，以上结果与生化鉴定、单重PCR和测序结果相符。此多重PCR方法不仅操作简便、经济快速，而且具有高度特异性、敏感性和良好的重复性，可用于仔猪渗出性皮炎的诊断和猪

3、葡萄球菌的快速鉴定。为了深入地研究猪葡萄球菌的代谢、生长特性及对宿主的作用。本研究运用上述多重PCR检测方法对48株葡萄球菌进行筛选，结合临床背景，经动物回归试验最终筛选出了一株具有较强致病力的猪葡萄球菌ZLT-1株，对ZLT-1株的菌体和培养物上清蛋白进行抽提，样品检测合格后经胶内酶解、液相色谱分离，最终进入质谱仪进行蛋白质全谱分析，通过GO、COG和通路分析对其结果进行诠释。结果表明，猪葡萄球菌菌体鉴定出919种蛋白，上清中鉴定出111种蛋白，大多数蛋白均参与了细胞生物过程、新陈代谢、黏附和催化过程；葡萄球菌常见33种致病因子中只有脱落毒素、乙酰转移酶、烯醇酶和甘油醛-

4、3-磷酸脱氢酶；通路分析发现了11种蛋白，7个与疾病发生、免疫调节和细胞凋亡有密切的联系的通路。进行蛋白全谱分析，将有利于找到潜在的致病因子及作用特点，为了解猪葡萄球菌对宿主的隐性影响提供科学依据。关键词：猪葡萄球菌；多重PCR；脱落毒素；质谱；蛋白组学EstablishmentofamultiplexPCRassayfordetectionofStaphylococcushyicusandProteomicAnalysisofZLT-1strainAbstractStaphylococcushyicus（S.hyicus）isanenvironmentcommonbact

5、eria,atthesametimeisthemainpathogenofpigletsexudativeepidermitis(EE).Inthisstudy,6pairsofspecificprimersweredesignedandsynthesizedbasedon6sequencesofexfoliativetoxingeneswhichwerereportedonGenBank.AmultiplexPCRassayfordetectedS.hyicusanditsexfoliativetoxingeneswasestablished.Theresultsofde

6、tectionof9clinicalisolationsindicatedthatthe23SrDNA(662bp)stripewereamplifiedinwholeisolationsandtheExhA(316bp),ExhC(525bp),ShetA(814bp)stripeswereamplifiedinsixisolations,eachtoxingenewereamplifiedfromtwodifferentisolations,threeotherswerenonetoxingenesamplificationsothatwereidentifiedavi

7、rulencestrains.Theseresultswerematchedwithbiochemicalidentify,nomalPCRandsequencing.ThismultiplexPCRassaywereeasytooperate,inexpensive,fast,ithasthehigherspecificity,sensibilityandbetterrepeatablity,canbeusedfordiagnosisofEEandfastidentifyofS.hyicus.Thenextstu