ndv lasota株基因组全长cdna载体和np、p辅助质粒的构建及鉴定

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1、华中农业大学硕士学位论文NDVLaSota株基因组全长cDNA载体和NP、P辅助质粒的构建及鉴定姓名：刘垒申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：肖运才201206新城疫病毒LaSota株反向遗传操作系统的初步建立摘要新城疫病毒(Newcastledisease，ND)是单股负链不分节段的RNA病毒，感染许多禽类的一种高度接触性疫病，对全世界养禽业导致巨大的损失。从上世纪人们开始用新城疫疫苗免疫，至今仍未根除本病。目前以新城疫病毒作为疫苗载体在人与动物都进行着广泛的研究。因为NDV具备很多作为疫苗载体

2、的优势，NDV作为疫苗载体接种途径简单，高滴度，低成本；其血清型只有一种，有相对的遗传稳定性，毒株间不易发生重组，毒力返强性小；在细胞浆内完成复制，从RNA到RNA，不会与细胞基因组整合；可稳定表达外源基因等。反向遗传操作技术的基础和应用研究，对RNA病毒具有革命性的意义，新城疫病毒利用这技术的研究也极为广泛深入。要启动病毒的转录复制，除病毒基因组RNA外，还需要病毒基因组的NP蛋白与病毒基因组RNA形成核糖核蛋白复合物(RNP)，P蛋白和L蛋白形成大聚合酶复合物，共表达启动病毒的复制。故拯救新城疫病毒，

3、不仅需要病毒基因组全长cDNA，辅助质粒的构建也是必不可少。本研究取得的结果如下：1．病毒基因组cDNA全长载体的构建将NDV接种9．10日龄的鸡胚，孵育7天，提取尿囊液中病毒I州A，反转录成eDNA。根据病毒基因组序列和载体中酶切位点的分析，分七个片段扩增病毒基因。选择载体pBR322作为转录载体，将丁肝病毒核酶序列和T7终止子连接其中得载体p3TH。用高保真DNA聚合酶PCR扩增获得七个基因片段，大小与预期相符，连接平末端载体，对重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析及测序分析，与GenBank序列号为JF

4、950510．1的NDV病毒序列进行BLAST比对，同源性达99％。NDV2和NDV3依次连接于载体pVAX，NDV6、NDV5和NDV4依次连接于载体pBluescriptIIKS+，将NDVl、NDV7、NDV23、NDV456依次连接于p3TH，成功构建了病毒基因组全长cDNA载体。2．辅助质粒pCl．NP、pCl．P的构建与表达鉴定设计特异性引物，RT．PCR扩增NP、P片段，大小与预期相符，NP、P酶切回收分别连接于真核表达载体pCl．neo，得到重组质粒pCl．NP、pCl．P。对重组质粒进行

5、PCR鉴定、酶切分析及测序分析，与GenBank序列号为JF950510．1的NDV病毒序列进行BLAST比对，同源性达99％。分别将辅助质粒瞬时转染BHK-21细胞，通过RT-PCR、Westernblot、间接免疫荧光检测NP、P基因在细胞中的表达。RT-PCR检测分别都有特异性的条带；Westernblot检测NP蛋白在约53KD处有褐色特异性条带，P蛋白在约43KD处有褐色特异性条带；间接免疫荧光检测NP蛋白、P蛋白能看到较多荧光。说明辅助质粒pCl．NP和pCl．P构建成功。本研究成功的构建了病

6、毒基因组eDNA全长载体和辅助质粒pCl．NP、pCl．P，为本实验室可开展新城疫病毒的反向遗传学操作系统的研究奠定了基础。关键词：新城疫病毒(NDV)；反向遗传学：全长cDNA；NP、P：II新城疫病毒LaSota株反向遗传操作系统的初步建立ABSTRACTNewcastlediseasevirus(ND)isnegative·strandRNAviruseswinlnon-segmentedgenomes，NDiscontagiousdiseasethatmanypoultryCanbeinfecte

7、d，whichhascausedhugelossesinpoultryindustry．Newcastlediseasevaccineshavebeenusedsincethelastcentury,butthediseasehaven’teradicatedyet．Currently,Newcastlediseasevirususedasavaccinevectorwascarriedoutextensivelyresearchinhumansandanimals．Asavaccinevector,ND

8、Vhasmanyadvantages，suchaseasytovaccination，high-titer,low-cost；onlyoneserotype，relativestabilityinhereditary,lesspossibletorestructureandvirulencebackinstrains；expressforeignproteinsathighlevel．Thatisrevolutionaryfo