猪链球菌2型与猪中性粒细胞相互作用研究

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1、华中农业大学硕士学位论文猪链球菌2型与猪中性粒细胞相互作用研究姓名：高小平申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：贝为成201206猪链球菌与猪中性粒细胞相互作用研究摘要猪链球菌2型(Strreptococcussuisserotype2，SS2)是一种人畜共患传染病病原，对于养殖业的健康发展以及人类的生命健康具有严重威胁。近年来，猪链球菌2型的危害引起国内外的广泛关注，其分子致病机理和免疫方面的研究是目前研究的热点。尽管很多学者从单个或多个毒力因子的角度去阐述猪链球菌2型的分子致病机理，取得了一些进展，但仍无法很好的解释其如何突破机体的天然免疫系统以及血脑屏障，从

2、而引起脑膜炎等病症。病原菌致病通常不是由单一毒力因子引起，而是由多种毒力因子的共同作用而造成的，毒力因子在调控系统的控制下，形成一个精致的调控网络。双组份调控系统(Two．ComponentRegulatorySystem，TCS)是细菌中广泛存在的一种重要的信号转导机制，能将外界环境中感应到的信息传给内部系统。研究证实，TCS参与调控细菌毒力因子表达、细菌致病性和生长代谢等，目前在SS2中发现有至少15对双组分调控系统。中性粒细胞(Polymorphonuclearleukocytes，PMNsorNeutrophils)存在血液中，是体内数量最多的白细胞，类似巨噬细

3、胞，具有吞菌活性，在急性炎症中起着十分重要的作用，是机体抵抗病原菌的第一道防线。病原与宿主的相互作用在其致病过程中扮演重要作用。尽管多种SS2毒力因子已被证实在致病中具有重要作用，但细菌与天然免疫系统作用后基因表达变化的全面分析报道却很少。而且，对猪链球菌2型引起急性炎症或逃避宿主天然免疫的分子机制了解非常有限。本文选取SS2野生株SCl9和猪中性粒细胞(PMNs)为研究对象，将SS2与PMNs相互作用后，通过基因表达谱芯片、生物信息学分析、荧光定量PCR等方法获得差异表达基因并分类；以CDl小鼠为模型评价双组份调控系统基因1660HK／RR．1910HK／RR和109

4、4HK／RR基因缺失突变株△1660HK／RR，△1910HK／RR、A1094HK／RR的毒力以及引起的炎症反应，为阐明双组份调控系统引起急性炎症反应或免疫逃避的分子机制，深入研究＆suis2分子致病机理奠定理论基础，也为Ssuis2新型疫苗和药物靶标分子设计提供新的思路。具体研究内容如下：1．猪中性粒细胞的分离和培养本研究采mFicoll．Hypaque密度梯度离心法分离PMNs，经Giemsa染色后检测PMNs的纯度为98％，采用苔盼蓝(O．01％浓度)排除法检测PMNs活力为96％，符合实验要求。2．猪链球菌2型感染猪中性粒细胞后转录表达谱结果与分析将SS2与P

5、MNs互作，并在O．5h、1h、和3h时间点采集样品制备表达谱芯片，与无中性粒细胞对照组的杂交后的表达谱芯片的信号值相比较，FoldChange(FC)华中农业大学2012届硕士学位论文≥2的转录本为上调，FC≤O．5的为下调，FC在O．5到2之间为无显著变化。结果表明，0．5h时有154个基因上调表达，188个基因下调表达；1h时有213个基因上调表达，223个基因下调表达；3h时有531个基因上调表达，665个基因下调表达。3个时间点都上调的基因有75个，都下调的基因有81个。进一步对差异表达的TCS基因分析发现，SSU050427、SSU050906、SSU050

6、944、SSU051358、SSU051595、SSU051660和SSU051685等7个基因一直上调表达；而SSU050883、SSU052090，2个基因一直下调表达；SSU050430、SSU051910和SSU052148，3个基因先下调表达后上调表达；SSU051094基因先上调表达，然后下调表达。3．TCS基因缺失突变株对致病性和炎症反应的影响在SS2与天然免疫细胞猪中性粒细胞的相互作用过程中，双组份调控系统基因呈现不同的表达情况，且在不同时间发挥作用。1094HK／RR、1660HK／RR和1910HK／RR基因分别在免疫反应的早期、中期和后期发挥作用。

7、以CD．1小鼠为模型，动物实验结果表明，双组份调控系统基因1910HK／RR、1094HK／RR和1660HK／RR缺失后，降低了宿主促炎症因子的表达水平，在12小时宿主炎症反应最为强烈；SS2抵抗PMNs吞噬的能力，以及SS2的致病性明显降低。关键词：猪链球菌2型；中性粒细胞；基因芯片；双组份调控系统；炎症。2AbstractStreptococcussuisserotype2(Ssuis2，SS2)isoneofthemostimportantswinepathogens，andanemerging，life—threateningz