粘膜免疫clpx蛋白对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制的实验研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文粘膜免疫ClpX蛋白对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制的实验研究姓名：钟文申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：尹一兵201205重庆医科大学硕士研究生学位论文粘膜免疫ClpX蛋白对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制的实验研究目的摘要肺炎链球菌(船印幻cDcc船舶e啪Dn妇e，S脚)定植于人类上呼吸道粘膜表面，能引起肺炎、脑膜炎、败血症等一系列疾病，在全球范围内有较高的发病率和病死率。随着抗生素耐药形势的日趋严峻，疫苗在预防肺炎链球菌感染性疾病中的作用愈发重要。肺炎链球菌ClpX属于HSPloo／Clp(酪蛋白水解酶)家族，作为ArP

2、酶亚单位与蛋白酶亚单位ClpP组成ClpXP复合物，有分子伴侣功能，在热应激耐受、底物识别等过程中发挥着重要的作用，与肺炎链球菌的生存、毒力密切相关，同时生物信息学提示该蛋白可能表达于细菌胞外，提示ClpX可能是一个较好的疫苗候选蛋白。因此，本研究旨在探讨ClpX粘膜免疫对肺炎链球菌的保护效果及其机制，评估其作为疫苗候选蛋白的可行性。方法利用原核表达技术从大肠埃希菌中表达出S朋C1pX蛋白(全长)，纯化后免疫BALB／c小鼠制备特异性多克隆抗血清。生物信息学预测&册中ClpX在细胞内外的表达情况，并利用所制备的aJlti—ClpX多克隆抗血清，经流式细胞术及Wreste

3、mblot对其进行亚细胞定位分析验证；3重庆医科大学硕士研究生学位论文PCR及、^『estemblot分析ClpX在9种不同血清型肺炎链球菌中的保守性；ELISA测定肺炎链球菌感染患儿、健康儿童以及健康成人血清中ClpX特异性IgG效价；以霍乱毒素(CholeraT0xm，CT)为佐剂，纯化重组ClpX(rClpX)蛋白经鼻腔粘膜免疫BALB／c小鼠，ELISA测定免疫后小鼠血清及唾液中特异性抗体效价及亚型，以及脾细胞经刺激后细胞因子的分泌水平。以&即CMCC31693(19F型)进行鼻腔攻毒，于攻毒第5天取小鼠鼻腔灌洗液，计数细菌载量；以S肿D39(2型)及CMCC3

4、1614(14型)分别进行鼻腔攻毒，监测小鼠生存率。结果成功构建pET-28(a)-啦Ⅸ重组质粒，经表达纯化后获得纯度>90％的重组ClpX蛋白；生物信息学分析预测ClpX可能为分泌型蛋白，流式细胞术结果表明ClpX不表达于S册表面；分离细菌亚组分进行W．estemblot分析，C1pX在S朋培养上清中检测出来，提示其为分泌型表达；PCR及VVestemblot结果显示，9种不同血清型&朋中ClpX均保守存在；健康儿童血清中ClpX特异性抗体水平高于同年龄组S脚患儿，且该抗体水平呈现年龄依赖性增长；与对照组相比，纯化rClpX蛋白粘膜免疫小鼠能有效刺激机体血清及唾液中产

5、生高滴度的埯G及IgA水平(P<0．01)，且血清中的IgG以IgGl及IgG2b为主；另外，粘膜免疫rClpX还能有效刺激机体脾细胞产生高水平的IL—17A和IL一4(P<0．05)．不同血清型S脚粘膜攻毒结果显示，粘膜免疫rClpX能显著降低19F型S印在鼻咽部的定植(P<0．001)，提高2型(P<0．05)和14型(P<0．01)S加攻毒后小鼠的生存率。4重庆医科大学硕士研究生学位论文结论肺炎链球菌ClpX蛋白为分泌型蛋白，在不同血清型S朋菌株保守性好，在人体中具有免疫原性，满足&肿疫苗候选蛋白的基本要求。粘膜免疫rClpX能有效刺激机体产生n2及Thl7介导为

6、主的免疫反应，对不同血清型Sp力的鼻咽部定植以及致死性感染有较好的保护效果。因此，ClpX蛋白是一种较好的肺炎链球菌疫苗候选蛋白。关键词：ClpX；热休克蛋白；肺炎链球菌；疫苗；粘膜免疫重庆医科大学硕士研究生学位论文THEEXPERIMENI'AI，RESEARCHONPROTECTIVEEFFECTANDMECHANISMSOFMUCOSALIMMUNIZATIONWITHCLPXAGAINSTPNEUMOCOCCALINFECTIONINMICEO蚴ectiveABST尉虻T脚幻∞cc哪J亡坍e姗删ae@训localizesontllemucosalsurfaces

7、ofthehostupperrespirato叮tract．Itcanbereadilyextendedf．romcarrierstatetodiVerselife—tllreateniIlgmVaSiveinfectionsuchaspneumonia，menmgitisandbactere皿a，caushlggreatmorbidityandmortalityworldwide．AstheantibioticreSistanceofS册deVelops，meneedofaproIllismgpreventiVes昀tegybecome