辣根过氧化物酶及免疫磁珠在肿瘤标志物检测中的应用

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1、重庆医科大学硕士学位论文辣根过氧化物酶及免疫磁珠在肿瘤标志物检测中的应用姓名：班艳娜申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：丁敏201205重庆医科大学硕士研究生学位论文辣根过氧化物酶及免疫磁珠在肿瘤标志物检测中的应用摘要目的：1．建立一种辣根过氧化酶(HRP)电化学检测法。2．建立一种免疫磁珠检测肿瘤标志物的电化学方法。3．考察免疫磁珠检测肿瘤标志物与酶联免疫法的相关性。方法：1一，3’，5，5’一四甲基联苯胺(TMB)一过氧化氢(H202)．HRP体系中HRP和HRP标记物的电化学检测方法。采用碳浆印刷电级为工作电极；检测体系为0．8mmol／LTMB溶液15皿，15mmol／L

2、雕JH202溶液25止，iJH／kHRP5．0x10。109／mE4止充分混合，滴加到印刷电极上，反应5min后进行测定。设定电压范围一0．1V．-一0．4V，先用循环伏安法进行定性分析，然后再用差分脉冲伏安法(DPV)进行定量测定。2．免疫磁珠在肿瘤标志物中的应用免疫磁珠按如下方法制备：首先，将链霉亲和素结合在带有环氧基官能团的磁珠上，利用链霉亲和素和生物素结合的特异性，将生物素标记的CAl99结合在磁珠上，形成生物素化的抗体磁珠复合物。最重庆医科大学硕士研究生学位论文后用1％的BSA封闭活性磁珠上的位点。若标本中存在相应的抗原则加入HPR标记的酶标抗体后，经过洗涤除去未结合的酶标抗体，最

3、后形成抗原一抗体．酶标抗体一磁珠的免疫复合物。利用磁珠的磁性可将此免疫复合物固定在磁场中的印刷电极上，加入底物缓冲溶液，用DPV进行检测。结果：1．DPV检测HRP浓度，在1．1x10。3～5．0x10ⅢeCmL浓度范围内与响应信号成线性，检测限为8．7x1013g／mL。2．电化学响应信号与CAl99抗原的浓度成线性，线性范围为3．0～60U／L。日间重复日内精密度为0．7～1．4％，日间精密度为1．0～6．9％。检测限为1．6U／mL。考察了制备免疫磁珠的稳定性，无保护剂的存在下稳定性为7天。结论：1．实现了电化学检测HRP及HRP标记物的方法，该方法简单快速、成本低、灵敏度高。2．实现

4、了免疫磁珠在肿瘤标志物中的应用，该方法快速、灵敏度高、适用于临床标本的检测。3．建立了免疫磁珠检测CAl99抗原的方法，与酶标免疫吸附测定有较好的相关性。关键词：3，3’，5，51_四甲基联苯胺盐酸盐；辣根过氧化物酶；差分脉冲伏安；免疫磁珠；肿瘤标志物；电化学3u重庆医科大学硕士研究生学位论文METHODFORDETERMINATIONOFTUMORMARKERBYTHEHORSERADISHPEROXIDASEANDObjective：IMMONOMANETICBEADSABSTRACT1．Toestablishananalyticalmethodfordeterminationtheho

5、rseradishperoxidase(HRP)activitybyelectrochemistry．2．Toestablishananalyticalmethodfordeterminationoftumormarkerimmobilizedmagneticbeadsbyelectrochemistry．3．Toinvestgateacorrelationofmethodsfordeterminationoftumormarkerbetweenimmobilizedmagneticbeadsbyelectrochemistryandenzymelinkedimmunoassay(ELISA

6、)．Method：1．MethodfordeterminationofHRPcatalyzedthe3，3’，5，5’一tetramethylbenzidine(TMB)byH202．Workingelectrodewasanalysedbyscreenprintedcarbonelectrode(SPCE)．Detectionconditions：substratesolutioncontainedwith0．8mmol／LTMB15肛Land15mmol／LH20225灿，whichreactedwith4肛L5．0xlO‘10g／mLHRPfor5minat37℃．TheHRPactM

7、tywas4重庆医科大学硕士研究生学位论文characterizedbyCyclicvoltammetryandquantitiedbyDifferentialpulsevoltammetry(DPV)attherangeof一0．1V～0．4Vrespectively．2．Determinationoftumormarkermodifiedofepoxy—functionalizedsuperparamag