mhc不同基因型哈萨克绵羊人工感染细粒棘球绦虫虫卵后小肠、肝脏差异表达基因的筛选

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1、DifferentialGeneExpressioninKazakhSheepwithDifferentMHCGenotypePerorrallyInfectedwithEchinococcusgranulosusEggsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgricultureByWenqiaoHui(AnimalGeneticsandBreeding)DissertationSuperviso

2、r:Prof.BinJiaJune,2013Shihezi,Xinjiang,China课题来源新疆重大疾病医学重点实验室开放课题《包虫病抗性与非抗性绵羊在六钩蚴侵染肠壁时期小肠组织中差异表达基因的筛选》国家自然科学基金《新疆哈萨克绵羊MHC抗性基因型个体MHC抗原作用六钩蚴虫体蛋白的筛选及抗性验证》(31060297)摘要细粒棘球蚴病，俗称包虫病，是细粒棘球绦虫的幼虫寄生于人、绵羊等中间宿主所致的一种人畜共患病。绵羊是细粒棘球绦虫最适宜的中间宿主，感染包虫病后生长发育缓慢，其毛、肉和奶的产量均严重受到影响，且患病绵羊肝、肺不能食用。最新调查显

3、示，新疆存栏绵羊4000多万只，饲养数达6000多万只，而包虫病患病率达到50%，这给畜牧业的健康发展以及广大农牧民的生产创收带来严重影响。本研究前期做了大量的关于绵羊主要组织相容性复合体基因（MHC基因）与包虫病抗性、易感性的相关研究，对新疆三个主要绵羊品种：中国美利奴羊、多浪羊及哈萨克羊MHC-DRB1基因外显子2进行PCR-RFLP检测，成功筛选出哈萨克绵羊与包虫病抗性相关的单倍型MHC-DRB1MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab，之后对带有该单倍型的绵羊（抗性组）和不带该单倍型的绵羊（非抗性组）进行人工攻虫，发现抗性组绵羊包虫

4、病发病率比非抗性组绵羊低且差异显著。在此基础上，本文着重对前期筛选的具有包虫病抗性和非抗性的哈萨克绵羊的感染机制及其差异进行分析。依据前期研究，本研究采用PCR-RFLP方法对250只哈萨克绵羊进行了相应抗性单倍型分析，共筛选出具有包虫病抗性的个体（基因单倍型为MHC-DRB1MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab）14只,非抗性个体（基因单倍型为MHC-DRB1MvaIbb-SacIIaa-Hin1Iaa）22只。进一步采用B超和ELISA结合的方法对筛选出的绵羊进行包虫病检测，随访后购买17只健康的绵羊，其中包括用于人工感染实验的绵羊

5、14只（抗性组和非抗性组各7只），以及健康对照的绵羊3只。MHC抗性组绵羊记为A组，MHC非抗性组绵羊记为B组，健康对照的绵羊记为C组。人工感染实验的14只绵羊每只饲喂约5000个成熟细粒棘球绦虫虫卵，建立人工感染细粒棘球绦虫模型后，开展了以下后续试验：1.实验一旨在检测不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫虫卵后早期机体免疫指标的差异。本实验分别于感染前(0d)、感染后2h、3h、4h、9h、1d、2d、3d、7d采集绵羊颈静脉血，采用ELISA方法检测血清中抗体（IgM、IgE）、细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10）

6、及趋化因子（CXCL-9、CCL17）的水平，结果显示，MHC包虫病抗性组（A组）表现出以抗体IgE、IgM、Th1细胞因子（IFN-γ、TNF-α）和Th1趋化因子（CXCL-9）为优势的分泌水平，而非抗性组（B组）则表现出以Th2细胞因子（IL-4、IL-10）和Th2趋化因子（CCL17）为优势的分泌水平。且IgE、Th1细胞因子（IFN-γ、TNF-α）在虫卵感染后4h组间差异显著。提示，携带MHC抗性基因型的绵羊表现出强的包虫病抵抗力可能受其早期高水平的Th1细胞因子及IgE抗体的影响。2.实验二旨在筛选出不同MHC基因型哈萨克绵羊感

7、染细粒棘球绦虫后小肠组织差异表达的基因。本实验中，实验动物分为MHC包虫病抗性组（A）、IMHC包虫病非抗性组(B)和健康对照组（C），A、B两组分别于感染后2h、3h、4h采集小肠组织，以C组健康绵羊作为健康对照组，采用基因芯片的方法分析不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫后小肠差异表达基因，其中感染组（A）、（B）与健康对照组（C）进行比较，结果发现:A与C之间差异表达的基因共4712个，其中表达量上调的有1959个，表达量下调的有2753个。B与C比较之后差异表达的基因4944个，其中2076个表达上调，2868个表达下调。从中选择

8、出同C相比，A和B同为上调或下调，且表达量差异显著的基因共141个，其中上调的有32个基因，下调的有109个。上调的32个基因中，A组显著高于B组的有