j亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及初步应用

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1、华中农业大学硕士学位论文J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及初步应用姓名：刘丽娜申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：栗绍文；罗青平201206J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及初步应用摘要禽白血病(Avianleukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)引起的鸡的各种可传播的良性和恶性肿瘤。J亚群禽白血病病毒(AI肛J)是90年代初期分离并鉴定的一个新的亚群，其传播性和致病性都比其他亚群强，可引起鸡的髓细胞瘤，给全球养鸡业带来巨大的经济损失。近几年，国内

2、部分省市出现大规模的禽白血病感染病例，主要以J亚群病毒感染为主。病毒的gp85基因是J亚群区别其它亚群的特异性序列。本研究利用原核表达系统表达ALV-Jgp85蛋白，建立J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法，利用杂交瘤细胞融合技术制备抗gp85蛋白的单克隆抗体。为我国J亚群禽白血病的血清监测和抗原诊断试剂盒的开发奠定了基础。研究结果如下：(1)根据GeneBank中ALV-J的gp85基因序列设计针对J亚群病毒的特异性引物，以本实验室保存的ALV-JXT0908毒株为模板，用RT-PCR方法扩增目的片段，测序结果显示

3、gp85基因片段与GeneBank中部分ALV-J核苷酸序列同源性在93．6％．98．2％。构建重组质粒pET-28a(+)．gp85，表达目的蛋白，使用His．镍亲和层析柱进行纯化。(2)用gp85蛋白作为包被抗原，建立J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法，并对该方法进行评价。结果表明该检测方法重复性良好，与禽源的几种病毒和细菌阳性血清均无交叉反应，并利用建立的ELISA抗体检测方法对临床血清样品进行检测，与IDEXX公司生产的抗体检测试剂盒符合率达到96．29％。。(3)用gp85蛋白免疫Balb／C小鼠，将SP

4、2／0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞进行融合，阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，并对杂交瘤细胞进行鉴定。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔制各腹水。用辛酸．硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化。结果表明，获得5株杂交瘤细胞：1G4、189、3A1、3D12、5G5。杂交瘤细胞上清抗体效价均在27以上，腹水抗体效价均在100x27以上，染色体数目均在79．93之间。Western-blotting鉴定结果表明，5株单克隆抗体均可以与gp85蛋白发生特异性反应。关键词：J亚群禽白血病；gp85蛋白；间接ELISA方法；单克隆抗体华中农业大学2012届

5、硕士研究生学位论文AbstractAvianleukosis(AL)isageneraldesignationofavarietyofavianneoplasticdiseases，whichiscausedbyavianleukosisvirus(ALV)．AvianLeukosisVirussubgroupJ(ALV-J)frombroilersWasidentifiedasanewsubgroupin1991．Itsepidemicandpathogenicityarestrongerthanothersubg

6、roups，whichCallcausemyeloidleukosis(ML)andenormouseconomiclossestotheglobalcultvafion．Recentyears，ALV—JcausedepidemicinseveralprovincesandcitiesinChina．gp85geneisthespecificnucleotidesequenceofALV-J．Inthisstudy，recombinantgp95proteinWaspmkaryoticlyexpressedinE．

7、coliandanindirectELISAfordetectingtheantibodyofALV-JWasestablished．Andthemonoelonalantibodiesagainstgp85proteinweredeveloppedbyhybridomacellfusiontechnology．ThestudyprovidedthebasisforserummonitoringofALV-Janddevelopmentofanfigendiagnostickits．Theresultsweresho

8、wedasfollows：(1)Accordingtothegp85geneofALV-JstrainspublishedbyGeneBank,apairofspecificprimersWasdesigned．TheALV-JstrainXT0908wasusedastemplate，andthegp85genewasamplifiedbyR