大鼠股骨骨不连模型制作与骨不连骨组织中基底膜蛋白多糖的检测

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1、青岛大学硕士学位论文2．10％EDTA脱钙液配制：1)称取EDTAl009：2)加入温热(60’7012)的蒸馏水约450mi，加入NaOHl59左右，搅拌至透明；3)加入0．摊的PBS500ml，调节pH值至7．2～7．3，PBS的终浓度为0．1M；4)蒸馏水定容至1000ml。1．2方法1．2．1大鼠股骨骨不连模型制作将雄性Wistar大鼠予以10％水合氯醛(300mg／kg)腹腔麻醉，麻醉成功后，用8％硫化钠脱毛术区皮肤，将动物俯卧位固定并消毒铺无菌巾单，取右侧髌旁纵行5mm切口，牵开髌骨暴露股骨远端内外侧髁

2、，从内外髁之间通过电钻逆行打入1．25ram克氏针l根，克氏针经髓腔自股骨近侧端穿出皮肤，截断远端克氏针保证远端埋入膝关节面下。取股骨中段外侧约Icm切口，沿肌问隙暴露股骨，充分保护周围肌肉血管等软组织，线锯锯断。实验组骨折端两侧各灼烧2mm骨膜，仔细操作防止灼烧致骨皮质坏死，正常对照骨折端不作处理。无菌生理盐水冲洗切口及皮肤并用5-o尼龙线缝合。造模后所有大鼠均正常喂养(避光安静，温度20～26℃，湿度低于80％)。手术当天X线拍片查看术后骨折对位对线情况(如图1．1)。图1．1大鼠股骨模型饲作术后X线(右)1．

3、2．2影像学检查分别于2、4、6、8周将大鼠行X线摄片，采用日本岛津1250型x线机，曝光条件：50kV，lOmAs，聚焦距离60cm。3第1章材料与方法1．2．3病理组织学检测两组分别于2、4、6、8周每次取出8只，颈椎脱臼处死，取出右侧股骨，取材包括骨折端、骨不连连接区组织及两侧正常股骨约0．5cm。立即用10％中性福尔马林固定24tJ',时，应用10％EDTA(乙二胺四乙酸)脱钙液(pH7．16)，磁力搅拌机搅拌，脱钙l周左右，每3天换液一次，注射器针头可轻松刺入骨质中表示脱钙完成，流水冲24d'时，冲去骨组

4、织标本中的EDTA，常规脱水、透明、迸蜡包埋，石蜡切片机制作距状，5am厚的石蜡切片。苏木精．伊红染色镜下观察。1．2．4免疫组织学检测将石蜡组织切片分别放入递减梯度酒精中脱蜡至水，新鲜配置的30ml／L过氧化氢液室温10分钟，灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水冲洗3次，每次3分钟，修复抗原：将切片浸入0．01M，pH6．0的枸橼酸钠缓冲溶液中，微波炉加热至沸腾，断电，间隔--．10分钟，再加热至沸腾，反复卜2次后，取出容器，室温冷却10一20分钟。取出切片，蒸馏水冲洗3次，每次2分钟。滴加一抗兔抗大鼠IgG，4℃过夜。

5、0．Olmol／1PBS洗3次，每次5min。滴加二抗(羊抗兔IgG)，室温下放置3h，0．01mol／1PBS洗3次，每次5min，显色。1．2．5结果处理采用Olympus显微镜，观察基底膜蛋白多糖在正常新生骨组织及骨不连骨组织中的阳性分布，每组大鼠每个时间点随机选取5张切片，每张切片选择两个视野，用显微图像分析仪在40倍变焦下对标本进行灰度测量，每个视野选择5个灰度值，取其平均值，从而每组每个时间点可得lO个灰度值，采用重复测量方差分析对所得数值进行统计学分析，P<0．05具有统计学意义。4第2章结果2．1一

6、般观察术后14,时，大鼠自然清醒状态，右下肢活动欠佳，无明显炎症表现，1周左右伤口愈合良好，活动自如。正常骨折愈合组及骨不连实验组各有2只大鼠术后伤口感染死亡，及时给予制作模型补充实验数量，标记后根据死亡时间相应推迟观察及模型检测时间点。术后2周取材骨不连组纤维组织填充，外周骨痂形成，正常骨折愈合组可见模糊骨性连接形成：术后4周，骨不连组纤维瘢痕组织填充断端，断端有异常活动，正常骨折愈合组可见明显骨性连接：术后6周，骨不连组软组织包绕骨折端，断端硬化，正常骨折愈合组骨折线基本消失；术后8周，骨不连组较术后6周无明显

7、变化，正常愈合组骨折线消失。图2．1骨不连实验组(术后8周)：骨折断靖硬化，骨膜剥离区(骨折线两饲各2m)两侧可有新生骨瘤形成，但不沿仲至骨折处2．2X线检查正常骨折愈合组：术后2周，骨折端外周新生骨痂形成，断端问云雾状影像；术后4周骨折断端间大量骨性连接形成，骨折间隙消失，骨折愈合进入骨板形成塑型期；术后6周骨折愈合，骨折线消失；术后8周，骨折愈合，较术后6周无明显变化(图2．2)。5青岛大学硕士学位论文骨不连实验组：该组大鼠在2、4、6、8周时，骨折均未愈合。术后2周，断端间隙较大，术后4周时，骨折断端间隙存在

8、，骨折端新生骨痂不明显，骨折两侧未剥离骨膜处可有少量新生骨痂形成，但未延至骨折端，无明显骨性连接。延至术后8周，断端骨皮质吸收，硬化，萎缩性股骨骨不连模型建立(图2．3)。图2．2正常骨折愈合对照组(术后8周)图2．3骨不连组【术后8周)2．3病理组织学检测正常骨折愈合组：术后2周，骨折端骨膜内成骨及软骨内成骨，骨小梁形成；术后4周，骨折端大量骨小梁形成，软