土茯苓化学成分分离及抗炎活性研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名蝉日期：力Df叶年多月；刁日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学

2、可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名论文导师日期：Ⅻ叩年摘要目的：为了全面揭示土茯苓抗炎活性物质基础，寻找活性强的土茯苓化合物，对土茯苓化学成分进行深入系统研究，并对分离得到的化学成分进行抗炎活性评价，对落新妇苷进行抗炎机制研究，为合理而有效的应用土茯苓提供科学依据。方法：1．土茯苓活性部位筛选土茯苓不同部位初步分离：将lOOg土茯苓用70％乙醇加热回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到的土茯苓总样上大孔树脂柱，依次予水

3、、30％乙醇、60％E,醇、95％乙醇梯度洗脱，大致划分土茯苓化合物极性范围而得到4个部位。土茯苓不同部位成分分析：分别以NaNO。-A1(NO。)。-NaOH、Folin—ciocalteu、香草醛一高氯酸、硫酸一苯酚为显色体系，采用分光光度法对土茯苓不同部位的总黄酮、总多酚、总皂苷、总多糖含量进行初步测定。土茯苓不同部位活性评价：抗氧化活性：以抗坏血酸(VC)为阳性对照，分别采用清除DPPH、ABTS自由基法及还原力测定3个抗氧化实验方法，评价土茯苓不同部位(12．5tag／mL、25lag／mL、50lag／mL、100lag／m

4、L)的体外抗氧化活性。抗炎活性：Griess法检测LPS(1ug／mL)和土茯苓不同部位(25ug／mL、50pg／mL、100ug／mL)共同作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其分泌N0的影响。2．土茯苓化学成分分离及结构鉴定：将7Kg土茯苓药材用70％乙醇加热回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到的土茯苓浸膏上大孔树脂柱，依次予水、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，对60％乙醇洗脱部位进行系统的化学成分研究，利用现代光谱学技术(UV，IR，ESI—MS，‘H-NMR，”C-NblR，DEPT，HSQC)鉴定化合物结构。3．土茯苓

5、化合物抗炎活性评价：MTT法检测土茯苓化合物作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其生长的影响，筛选安全浓度范围。Griess法检测LPS(1lag／mL)和土茯苓化合物(安全浓度范围内)共同作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其分泌NO的影响。ELISA法检测LPS(1ug／mL)和土茯苓化合物(已鉴定结构的化合物)共同作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其分泌TN卜Q的影响。4．落新妇苷抗炎机制研究：MTT法检测落新妇苷(10lag／mL、20pg／mL、40

6、lg／mL)作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其生长的影

7、响。Griess法检测LPS(1ug／mL)和落新妇苷(10lag／mE、20ug／mE、4011g／mL)共同作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其分泌N0的影响。ELISA法检测LPS(Iug／mL)和落新妇苷(10llg／mL、20ug／mL、40llg／mE)共同作用于RAW264．7巨噬细胞24小时对其分泌TNF—a的影响。Real—timePCR法检测LPS(1ug／mL)和落新妇苷(10ug／mL、20llg／mL、40ug／mL)共同作用于RAW264．7巨噬细胞12小时对其IL一6、TNF-a和iNOSmRNA表达

8、的影响。WesternBlot法检测LPS(1ug／mL)和落新妇苷(5ug／mLi0ug／mL、20ug／mL、40ug／mL)共同作用于RAW264．7巨噬细胞1小时对其P-P65、P-P38、P-JNK、P-ERKI／2信号通路表达的影响。结果：I．土茯苓活性部位筛选结果：土茯苓药材提取率为16．7％，土茯苓总样(TFL-Z)经初步分离后得到4个部位：水部位8．49(TFL一1)，30％乙醇部位4．59(TFL一2)，60％乙醇部位29(TFL一3)，95％乙醇部位0．79(TFL一4)，土茯苓化学成分随着洗脱溶剂极性变化而重新分

9、布，其中总黄酮、总酚酸、总皂昔类物质主要富集在TFL-2和TFL-3部位(P