基于气相色谱--质谱联用技术的肾细胞癌代谢组学研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文基于气相色谱一质谱联用技术的肾细胞癌代谢组学研究Metabonmicsstudyonrenalcellcarcinomausingcombinedgaschromatography-·massspectrometrytechnology课题来源：广东省科技计划项目：2012A032200016学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员张琳曾方银临床检验诊断学专业型硕士第一临床医学院2014年3月18日广州硕士学位论文基于气相色谱一质谱联用技术的肾细胞癌代谢组学研

2、究研究生姓名：张琳指导老师：曾方银摘要研究背景和意义肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，仅次于膀胱癌和前列腺癌，占肾脏恶性肿瘤的80．90％。肾细胞癌起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌，简称肾癌，包括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞亚型，RCC与肾小管上皮细胞病变相关。流行病学调查显示肾癌约占成人恶性肿瘤的2％～3％，，各国和各地区的发病率不同，发达国家发病率及死亡率高于发展中国家，我国各地区肾癌的发病率和死亡率差异也较大。RCC可发生于各个年龄段，高发年龄为5

3、0．70岁，男女之比值约为2：1。RCC的病理分类较多，共有10类，其中肾透明细胞癌(clearcellrenalcancer，ccRCC)是最常见的。RCC的发病因素目前还不清楚，起病隐匿，早期缺乏特征性的症状体征，经典血尿、腰痛、腹部肿块“肾癌三联征”临床出现率不到15％。临床诊断缺乏可靠的实验室诊断指标，主要靠影像学检查，确诊需依靠病理学检查，RCC的早期诊断手段的缺乏使得早发现早治疗具有一定的困难。因RCC的多重耐药性和生物学特性，对放化疗及激素治疗均不敏感，手术治疗被认为是唯一可以治愈早期肾癌的方法，因此RCC的早期诊断

4、仍是当前很多医学工作者研究的重点。目前一种新的利用高分辨率分析技术分析样品中系列小分子的代谢物图谱，进而筛选差异代谢产物作为标志代谢物的的方法引起了广泛的兴趣。代谢组学(metabolomics)是继基因组学，蛋白质组学之后兴起的系统生物学摘要的一个新的分支。代谢组(metabonome)指一个细胞、组织或器官中所有代谢组分，尤指小分子物质，而代谢组学则是--l'-J在新陈代谢的动态过程中，生物体(从细胞到整体生物)受刺激或紊乱前后(如将某个特定的基因变异或环境改变后)其代谢产物种类、数量及其变化规律，揭示机体生命活动代谢本质的科

5、学。代谢组学研究的关键在于研究这些因内源性或外源性的刺激所引起的终端大量小分子代谢产物(主要是相对分子质量在1000以下的内源性小分子)的变化规律，进行快速、准确的分析鉴定，全面动态地揭示生理或病理状态下生物体对外界的应答反应变化过程，为了解RCC的发生机制提供一个新视角。联合细胞代谢组学和RCC患者体液代谢组学研究，能得到更多的疾病相关信息，有利于RCC的早期诊断。此外，本次研究的临床样本采用的是尿液样本，采集过程方便、无创无辐射，利于大规模的体检筛查。研究目的建立基于气相色谱质谱联用技术的肾癌细胞培养上清和RCC患者尿液的代谢

6、组学研究方法，建立数据模型，筛选RCC特异性代谢标志物并加以验证，为临床RCC的早期诊断提供新的诊断标志分子。研究方法：1．细胞培养人肾透明细胞癌细胞786．O和HK-2细胞的培养按照常规的细胞培养方法，培养基质为含10％小牛血清的DMEM，置于37"C恒温、5％C02的培养箱中培养，每24h用倒置显微镜观察细胞生长情况，每2．3天用胰酶消化、传代培养，取生长状态良好的细胞用于实验。2．制作细胞生长曲线细胞计数法测定786．O细胞及HK-2细胞的生长曲线按每孔O．5x104／mL细胞密度分别接种于24孔板中，培养条件如上。24h后

7、计数，以后每隔24h计数一次，每次各取3孔细胞，分别计数，每孔重复三次，取其平均值。连续计数7d。根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以II硕士学位论文培养时间为横坐标绘制生长曲线。3．代谢组学样本采集、前处理及GC．MS检测体系的建立细胞水平的分析采用48h培养上清；临床样本收集27例RCC患者、26例泌尿系其它肿瘤及26例健康对照者的尿液标本。细胞上清采用含1％--甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane，TMCS)的N．0．双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(trimethylsilane··N--

8、O·-double(threemethylsiliconall【y1)fluoroacetamide，BSTFA)进行衍生化，尿液采用氯甲酸乙酯(ethylchloroformate，ECF)衍生化，然后进行GC．MS分析。该部分内容包括：(1)样