基因调控延迟减毒和提高异源抗原表达的猪霍乱沙门氏菌载体的构建

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1、基因调控延迟减毒和提高异源抗原表达的猪霍乱沙门氏菌载体的构建ConstructionofregulateddelayedaRenumedSalmonellacholeraesuisevectorwithenhancedheterologousantigenprotein国家自然科学基金(31172300)江苏省高校自然科学重大项目(12KJA230002)高等学校博士学科点专项科研基金(博导类)(20133250110002)江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心研究生：吉贞颖专业：基础兽医学导师：石火英教授扬州大学兽医学院2

2、014年5月基因调控延迟减毒和提高表达异源抗原猪霍乱沙门氏蔼载体的构建基因调控延迟减毒和提高异源抗原表达的猪霍乱沙门氏菌载体的构建硕士研究生：吉贞颖导师：石火英教授摘要沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌，其减毒后具有良好的侵袭能力，在体内生长缓慢，能够有效地持续刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。但是经过改造过的病原菌，要么过度减毒，损伤了免疫原性；而当保留了较好的免疫原性，细菌却不够减毒，引起宿主的各种临床症状。本文以野生型猪霍乱沙门氏菌强毒株C78．3为载体，利用细菌分子生物学技术，对猪霍乱沙门氏菌强毒株C78．3染色体进行基因改造，使猪霍乱沙门氏菌突变株在甘露

3、糖和阿拉伯糖的调控下，其毒力逐渐减弱的同时，所携带的外源抗原的表达得以不断提高，最终使减毒株在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的入侵能力，侵入宿主后由于毒力基因的失表达而毒力减弱，以保障疫苗候选株的安全性，然而其质粒所携带的外源抗原的表达能够不断提高。本研究在C78—3中共引入APcrD：：TTaraCPBADcrp，AmanA，AreIA：：araCPBADlacITT币HAasdA四个突变，该减毒株被命名为x0011；将猪链球菌2型的6．磷酸葡萄糖脱氢酶基因(简写为6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中，形成疫苗候选株妒011(pYA6一PGD)；最

4、后对x0011(pYA6．PGD)的生物学特性进行了分析。1．减毒猪霍乱沙门氏菌徊011的构建本部分在猪霍乱沙门氏菌强毒株C78．3上分别引入由甘露糖调控的AmanA突变和由阿拉伯糖调控的APcrD：：TTaraCPsADcrp和ArelA：：araCPBAD／adTT突变。AmanA突变使突变菌的man,4基因在没有甘露糖时不能表达，导致突变菌不能合成细菌LPSO一抗原的侧链而减毒：AP。邛：：TTaraCPBADcrp是在没有阿拉伯糖时，突变菌的crp基因不能表达，导致突变菌不能合成crp蛋白而减毒；ArelA：：araCPBADlacITT突变是由阿拉伯糖控制lacl基因

5、的表达，从而使外源基2硕士学位论文因在没有阿拉伯糖的动物机体内可以高效表达；引入的AasdA突变使减毒株(asdA一)与蛋白表达载体pAY3493(asdA+)形成平衡致死系统，使得只有携带外源抗原质粒的疫苗候选株才能稳定地在动物机体内复制。依据无抗性标记缺失基因的自杀载体方法，首先分别构建含缺失基因APcrD：：T1’araCPBADcrp，AmanA，ArelA：：araCPBADlacITT和△以s臼H结构的自杀载体；即在GenBank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到在猪霍乱沙门氏菌上拟缺失基因或启动子的上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的300bp左

6、右为同源臂，删除拟缺失基因或启动子序列，以猪霍乱沙门氏菌C78．3为模板，经PCR等分子生物学技术，获得删除基因或启动子序列后与C78—3有500～600碱基的同源臂序列，将此同源臂序列连接至自杀载体质粒pREll2(pREll8)上，通过酶切鉴定和序列测定，将正确缺失基因或启动子序列的pREll2载体转化至工程菌大肠杆菌z7213中，获得自杀载体妒213(pYAs001)(APcrp：：TTaraCPBADcp)，Z7213(pYAs002)(AmanA)，x7213(pYAs003)(ArelA：：araCPBAD／ac／TT)和；c7213(pYAs004)(AasdA)

7、。然后以猪霍乱沙门氏菌强毒株C78．3为受体菌，含自杀性质粒的Z7213为供体菌，运用自杀载体介导的同源重组技术，在C78—3上分别引入AP。∞：：TTaraCPBADcrp，AmanA，ArelA：：araCPBAD／ac／TT和AasdA，最后获得炉011(AP。rp：：TTaraCPBADcrp，AmanA，ArelA：：araCPBAD／ac／TT和AasdA)减毒株。2．减毒猪霍乱沙门氏菌载体妒o11生物学特性的研究本论文的目的是用基因调控的方法，使减毒载体在入侵宿主机体时能够具有