大鲵蛙病毒lamp检测方法的建立与应用

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1、万方数据ClassificationNumber$941．41StudentNumberS2Q!!三Q22SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationDevelopmentandapplicationofLoop·-MediatedIsothermalAmplificationfordetectionofChineseGiantSalamanderRanavirusByLiuXing--xingDirectedbyProf．GengYi(BasicVeterinaryMedic

2、ine)Sichuan，Ya’an，ChinaJune，2014删0嗍1万方数据0删22J12一本研究由四川省科技支撑项目(2014NZ0027)资助。ThisstudyissupportedbySichuanTechnologySupportPlanning(2014NZ0027)．万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他／卜人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所

3、使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：斟盈是幻f中年∥月妒日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：翮咎丑孑善；>．，r甲年r月P日彦，，e年f月G日万方数据中文摘要大鲵fAndriasdavidia

4、nusBlanchard)俗名“娃娃鱼”，属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属，是我国现存最大的也是最珍稀的物种，并被列为国家1I类重点保护野生动物。我国在上个世纪70年代对大鲵进行驯养和繁殖试验，随着大鲵人工繁殖的成功，大鲵养殖在陕西、四川、湖南、重庆、甘肃等省市快速发展，并逐步成为优势特色产业。大鲵蛙病毒(ChineseGiantSalamanderRanavims，CGSRV)是近些年来发现的一种严重危害大鲵养殖的新型病原微生物，它感染大鲵主要表现为体表出现溃疡及大量的出血斑点，头部与四肢出现肿胀，有时形成溃疡灶，被人们称为“溃疡病

5、或大脚病”，一旦发病，很难治愈，死亡率高，甚至高达100％，故被养殖户们称为“大鲵的癌症”。本研究建立了大鲵蛙病毒的LAMP检测方法，以期为CGSRV的早期、快速、特异性诊断及该病的预警提供技术保障。根据GenBank中登录大鲵蛙病毒MCP基因序列(登录号：HQ684746)，利用LAMP引物设计网站(primerExplorerV4(http：／／primerexplorer．jp／e／)设计4条特异性引物：F3：5’一GAGGGcGTACTTTTGGGC一3’；B3：5’一ATGCCACCTCCATCCCA．3’：FIP：5'-TAA

6、CGTCACCCTGTCCGCTGA—CAGAGTTGTCACCTCCGC．3’：BIP5'-TCTGCCGTAATTGGTGGATCCG-GGCACCACCTCTACTCCTA．3’。经过对M92+浓度、引物浓度、dNTPs浓度和BstDNA聚合酶浓度、反应温度、反应时间进行优化，成功建立了CGSRV的LAMP检测方法。最佳反应温度为62。C，最佳反应时间为40min，反应体系为259L，llxLF3(IOgM)，(B3(10pM)，(FIP(50¨M)，(BIP(509M)，3．5灿dNTPs(25mM)，49L10xThermopo

7、lbuffer，8UBstDNA聚合酶，31aLMgCl2(25mM)，2止模板DNA和7．51．tLddH20。结果表明，该LAMP方法对CGSRV最低检测限5copies／gL，而巢氏PCR币H常规PCR的检测限为50copies／此和5x103copies／gL，表明该LAMP方法的灵敏度显著高于巢氏PCR和常规PCR；且特异性强与锦鲤疱疹病毒、金鱼疱疹病毒2型、云斑尖塘鳢虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、迟钝爱德华菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌等均无交叉反应。在对经普通PCR与巢氏PCR检测阳性的55例疑似患蛙病毒感染样本及8例阴

8、性样本，采用建立的LAMP技术检测发现，其结果与普通PCR及巢氏PCR的检测结果一致。再运用以上三种方法对32例疑似样品进行检测发现，万方数据LAMP反应检测出30种，检测率高达93．75％，