sybrgreenⅰ荧光定量rtpcr检测j亚群禽白血病病毒方法的建立及应用

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1、摘要J亚群禽白血病((AvianLeukosisVirusSubgroupJ,ALV-J)是由J亚群禽白血病病毒引起的鸡骨髓样细胞瘤以及其它肿瘤性性疾病。1999年，我国首次由杜岩等在肉鸡的商品代中分离了ALV-J。J亚群禽白血病在我国呈现了不断发展的态势,宿主范围已从肉用型鸡向蛋鸡和地方鸡种蔓延,病鸡的生产性能降低，死亡率明显升高,给我国养禽业造成严重的经济损失。因此，建立快速、特异和敏感的ALV-J检测方法具有重要的实际意义。为建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测ALV-J的方法，本研究以ALV-J原型毒株HPRS-103基因组中pol基因3’端和gp85基因之间的保守区域作为检

2、测靶基因片段，构建其重组质粒作为阳性标准品，通过对模板浓度、引物浓度和退火温度的优化，建立了ALV-JSYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示该方法的最低3检测限度为2.36×10DNA分子/μL，较普通PCR提高100倍；可特异性扩增出545bp的ALV-J目的基因，而对其他禽源病毒无交叉反应；批内变异系数为0.17~2.43%，批间变异系数2.73~3.68%，均小于5%。表明所建立的方法较高的灵敏性、很强的特异性、好的重复性和稳定性。根据所建立的荧光定量RT-PCR方法对临床样品和市售禽类疫苗进行检测。在所检测的12种不同禽类疫苗中均未检测到ALV-J，表明所检测的市售禽类弱

3、毒苗中无ALV-J污染。在所检测的4个品种125只临床疑似病鸡中ALV-J阳性检出率为46.40%（58/125），其中岭南黄肉鸡、淮南麻黄鸡、地方鸡种和京红1号蛋鸡的阳性检出率分别为65.31%（32/49）、55.26%（21/38）、31.25%（5/16）和0%（0/22），表明不同品种的鸡对ALV-J的易感性不同。选择10只27周龄阳性感染期岭南黄肉鸡，应用荧光定量RT-PCR方法检测不同脏器中ALV-J的分布及其mRNA表达水平。结果发现在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均能检测到病毒基因，多重比较检验分析显示肾脏中ALV-J基因mRNA表达水平显著高于其他脏器，而肺脏、心脏、肝

4、脏和脾脏之间无明显差异。这为进一步研究机体与病毒之间的相互作用，以及致病机理的探明奠定了基础。综上所述，本试验建立的荧光定量RT-PCR方法是一种特异、快速（6h左右）和较灵敏的检测方法，可用于快速诊断临床样品、净化鸡场效果检测以及在不同脏器中病毒的表达水平的研究。关键词：J亚群禽白血病病毒，荧光定量PCR，定量检测，应用IAbstractSubgroupJAvianLeukosisreferredtochickenmyeloidcelltumorandothertumordiseasescausedbyAvianLeukosisVirussubgroupJ(ALV-J).ALV-Jwas

5、isolatedfromcommercialbroilersforthefirsttimein1999inChina.ALV-JhasspreadwidelyoverChinasince2000,anditshostrangeextendedfrommeat-typechickenstolayinghensandlocalchickenbreeds.Productionabilityofinfectedchickenswasdecreasedandthemoralitywasquicklyincreasing,whichhadbroughtgreatlossesfordomesticpou

6、ltryindustry.Therefore,theestablishmentofarapid,specificandsensitivemethodfordetectingALV-Jisofgreatsignificance.Inthisstudy,aSYBRGreenⅠ-basedfluorescentquantitativePCRassayfordetectingAvianLeukosisVirussubgroupJ（ALV-J）wasdevelopedandapplied.Theconservativeregionbetweenpolandgp85geneoftheHPRS-103s

7、trainofALV-JwasamplifiedbyconventionalPCRandwasclonedintopMD18-TvectorservedaspositivestandardtoestablishfluorescentquantitativePCRstandardcurve.AndthenthedetectingmethodofALV-JSYBRGreenIfluorescentquantitativePC