马流感病毒分离鉴定及甲病毒复制子载体疫苗的研究论文

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1、摘要马流行性感冒(Equmeinfluenza，E1)是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感属(Influenzavirus)中的马流感病毒(Equineinfluenzavirus，EIV)引起的一种急性接触性呼吸道传染病。该病在马属动物中极易传播，多呈暴发性流行，发病率高病死率低。EIV有两个亚型，分别为H7N7和H3N8亚型。由于疫苗接种等防控措施，H7N7亚型EIV在马群内已经消失很久，但是疫苗接种并没有有效地预防H3N8亚型EIV在世界范围内的蔓延。我国的EI疫苗市场一直处于空白

2、，而进口疫苗应用的毒株都是上世纪90年代分离的流行毒株，随着马流感疫情在我国的不断变化，亟需应用在我国EI流行时分离到的毒株来制各马流感疫苗。鉴于此，本论文通过对我国黑龙江省分离到的两株EIV的遗传演化规律的分析，总结现今在我国流行的EIV流行株的特点，选择适合在中国作为疫苗株应用的EIV分离株，制备能够有效预防EI在我国蔓延的候选疫苗。本研究采集发病马匹的鼻拭子样品，进行病毒的分离鉴定。结果表明，两种样品的分离物均能够在9．10日龄的鸡胚上进行盲传，收集的尿囊液都具有血凝效价，稳定传代后病毒的血凝价分别达到

3、256和128，病毒的EID50为10S／mL和107’5ImL：通过对浓缩的鸡胚尿囊液以及病毒在细胞上传代之后的切片进行电镜观测，能够观察到病毒粒子多成呈椭圆形(但也有不规则形状)，病毒粒子的直径为100nm，具有流感病毒的典型特征。通过对两株病毒株的HA基因的扩增和遗传进化分析表明，该流感病毒的HA基因都与马的流感病毒处于同一簇，为典型的马流感病毒，并且分别命名为AJequine／Heilongjiang／1／2010和A／equine／Heilongjiang／1／2011，该株与A／equine／Xi

4、njiang／3／07(H3N8)株同源性达99％，属于H3N8亚型EIV美洲型佛罗里达II型。为了研究我国马流感病毒的遗传变异情况，将两株分离株与其他32株EIV的氨基酸序列进行比对，包括一些中国分离到的毒株、外国毒株以及6株OIE推荐的疫苗株，结果表明，我国近年来分离的马流感病毒为佛罗里达II型的H3N8EIV，与蒙古分离株A／Mongolia／I／2008同源性较近，这些病毒都起源于欧洲近年来流行的佛罗里达II型EIV，但与日本分离株(A／equine／Tokyo／I／07)亲缘关系较远，日本分离到的E

5、IV毒株都属于佛罗里达I型EIV，同时与我国90年代分离的欧洲型EIV也处于明显不同的进化分支。为了制备出适合在我国应用的马流感疫苗，根据上述分析的当前我国马流感病毒的遗传变异特征，本研究选用在我国分离的毒株，欧洲型马流感病毒A／equine／Qinghai／l／1994(H3N8)和美洲型马流感病毒A／equine／Xinjiang／3／2007(H3N8)，作为疫苗株，拟用甲病毒复制子载体为基础研制马流感疫苗。分别构建了表达上述两种毒株的保护性抗原基因HA基因的两种重组质粒，经过酶切、PCR、测序和间接免

6、疫荧光鉴定证实本实验构建的两种甲病毒复制子重组质粒能够正确地表达外源基因。为进一步研究该重组疫苗对实验动物的保护效果奠定了基础。为了进一步验证该重组甲病毒复制子载体疫苗的保护效果，我们将两种DNA疫苗分组免疫小鼠，疫苗免疫后进行攻毒保护试验。试验结果表明，本研究所构建的两个重组质粒在低剂量组时就可以诱生与常规型DNA载体疫苗高剂量组的免疫效果，诱导小鼠产生针对病东北农业大学农学博士学位论文毒的抗体，抗体水平在加强免疫后明显升高；复制型DNA疫苗免疫组均能引起CD4+T细胞以及CD4+T／CD8+T的显著上升；

7、同时，在小鼠体内也可引起IFN-7、IL．2和IL．4水平的提高，尤以前两者的升高更明显；攻毒后，重组质粒免疫组能够保护小鼠抵抗流感病毒的攻击，而对照组小鼠均感染马流感病毒。本研究所构建的重组质粒于小鼠的免疫效力、体内免疫反应以及不同免疫剂量对免疫效果影响的评估，证实我们所构建的表达H3N8亚型马流感病毒的甲病毒复制子DNA疫苗能够保护小鼠抵抗流感病毒的感染，为进一步在马体中进行EIV免疫机理的探索奠定了基础，该重组疫苗具有良好的应用前景。关键词马流感病毒；甲病毒复制子载体；HA基因；DNA疫苗IIAbstr

8、actIsolationandidentificationofequineinfluenzavirusandstudyonAlphavirusrepliconvectoredvaccineEquineinfluenzaisacommonviralrespiratorydiseaseofEquuscausedbyorthomyxovirusofthegenusinfluenzaA．Equineinfl