猪脑心肌病毒（emcv）的检测 反转录聚合酶链反应法（rt-pcr）

《猪脑心肌病毒（emcv）的检测 反转录聚合酶链反应法（rt-pcr）》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS11.220B42DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXX—2011猪脑心肌病毒（EMCV）的检测反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2010年12月）2011-XX-XX发布2011-XX-XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXX—2011目次前言II1　范围12　术语和定义13　材料准备13.1　用于猪EMCV检测的特异性引物13.2　试剂23.3　仪器设备及耗材34　操作方法34.

2、1　待检样品处理34.2　待检样品总RNA提取34.3　RT-PCR检测44.4　注意事项45　PCR检测结果判定55.1　电泳55.2　结果判定5附录A（规范性附录）　引物序列及检测结果判定6附录B（规范性附录）　溶液的配制7附录C（规范性附录）　溴化乙锭的净化处理8附录D（资料性附录）　本标准词汇英汉对照表109DB45/TXXXXX—2011前言聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种核酸体外扩增技术，应用该技术对猪脑心肌炎病毒进行快速鉴别检测具有重大意义。本

3、技术规程在充分参考文献资料、经过实验室和生产应用验证的基础上制订的，适用于猪脑心肌炎病毒的检测。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：施开创、郑敏、莫胜兰、胡杰、屈素洁、李军、刘棋。本标准为首次发布。9DB45/TXXXXX—2011猪脑心肌病毒（EMCV）的检测反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）1　范

4、围本标准规定了猪脑心肌炎病毒（EMCV）检测的材料准备、操作方法及结果判定。本标准适用于猪脑心肌炎病毒的检测。2　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1　脑心肌炎病毒encephalomyocarditisvirus（EMCV）脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus,EMCV)属于微RNA病毒科心病毒属的成员，其核酸为单股正链RNA，基因组核苷酸长度大约7.8kb。EMCV可以引起某些哺乳动物、乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。EMCV在

5、猪主要以断奶仔猪的急性心肌炎、突然死亡以及母猪的繁殖障碍为特征。临床上仔猪表现为突然死亡、心肌变性、出血、呼吸困难，而母猪常无明显的临床症状或表现出严重的繁殖障碍。病猪的心脏、扁桃体、胰腺、脾脏、肠道及肠系膜淋巴结等均有肉眼可见的病变，其中以心内膜、心外膜和心室乳突上的灰白色条状或圆形坏死灶为其主要特征。2.2　聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）PCR技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性→复性→延伸三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目的

6、DNA得以大量扩增。2.3　反转录reversetranscription以RNA为模板合成cDNA的过程。2.4　引物primer与待扩增DNA片段两侧互补的一小段寡核苷酸。3　材料准备3.1　用于猪EMCV检测的特异性引物9DB45/TXXXXX—2011参考GenBank上猪源EMCVBJC3毒株（GenBank登录号：DQ464062）的3D序列，选择保守区域设计并合成一对引物。引物序列见附录A.1.1。该引物可以特异性扩增病毒的3D基因，扩增片段长度为286bp。1.1　试剂1.1.1　猪EM

7、CV特异性引物上、下游引物的使用浓度均为25pmol/µL。1.1.2　RNA抽提试剂盒使用宝生物工程（大连）有限公司生产的MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0试剂盒1）MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0试剂盒是由宝生物工程（大连）有限公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)。试剂盒包含了提取RNA所需的除1%冰乙

8、酸异丙醇以外的全部试剂：——SolutionA；——SolutionB；——RinseA；——RinseB；——Spincolumn；——ElutionBuffer。1.1.3　RT-PCR试剂盒使用天根生化科技（北京）有限公司生产的Quant一步法RT-PCR试剂盒2）Quant一步法RT-PCR试剂盒是由天根生化科技（北京）有限公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同