ecsod基因转染mscs移植治疗缺血性脑卒中大鼠的实验研究

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1、万方数据中图分类号＆2垒三：三垒UDC鱼!Q硕士学位论文学校代码!Q§圣三密级公珏ECSOD基因转染MSCs移植治疗缺血性脑卒中大鼠的实验研究ResearchonMSCstransfectedwithECSODgenefortreatmentofischemicstrokeinRats作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：胡昔奇临床医学外科学(神经外科)湘雅医学院附属海口医院夏鹰教授论文答辩日期迦!笙：!二骖答辩委员会主席中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工

2、作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任作者签名：辨日期．巡年』月三日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编

3、入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：蝣日期：皿年上月立日聊签名塑曰期：型年』月二日万方数据ECSOD基因转染MSCs移植治疗缺血性脑卒中大鼠的实验研究摘要：第一部分ECSOD基因表达载体的构建并转染至骨髓问充质干细胞的实验研究实验目的：构建胞外超氧化物歧化酶(extrace1lularsupero—xidedismutase，ECSOD)基因表达载体，经慢病毒包装后转染至成年Sprague—Dawley(SD)雄性大鼠的骨髓间充质干细胞(bonemar—rOWmesench

4、ymalstemcell，MSCs)，观察和检钡IJECSOD基因的转染效率及转染后对细胞活力的影响与ECSOD蛋白表达情况。实验方法：利用基因工程技术从MSCs中提取总的RNA，经PCR扩增、载体双酶切后，获得ECSOD基因片段，将其基因片段连接到GV230一EGFP载体构建GV230-EGFP-ECSOD表达载体，经菌落PCR及测序，鉴定载体构建是否成功，采用慢病毒包装后将GV230-EGFP—ECSOD导入MSCs中，荧光显微镜检测转染效率，实时荧光定量多聚酶链反应(Quantitati—vePolymeraseChainReaction，

5、QPCR)对转染后对MSCs中mRNA定量分析，MTT及EDU检测转染后ECSOD基因对细胞活力与增殖影响，WesternBlot检测ECSOD基因表达情况。实验结果：提取RNA产物经PCR扩增、双酶切成功将目的基因连接至真核表达载体GV230一EGFP中，菌落PCR获得目的基因大小和阳性对照一致，菌落PCR阳性转化子经测序分析与目的基因序列完全一致；慢病毒包装的GV230-EGFP-ECSOD成功转染至MSCs，培养48h后在荧光显微镜下观察并计算得MSCs转染率为(75±3．6)％，进一步采用QPCR定量测定转染后mRNA含量明显高于对照组。

6、EDU与MTT检测发现ECSOD基因转染MSCs后对细胞活力无影响。WesternBlot检测证实ECSOD基因转染MSCs后，MSCs中ECSOD蛋白呈阳性表达。实验结论：成功构建GV230-EGFP-ECSOD真核表达载体，通过慢病毒包装转染技术将ECSOD基因转染至UMSCs中且表达ECSOD蛋白，进而为下一步研究ECSOD基因转染MSCs治疗脑梗塞动物模型奠定实验基础。关键词：ECSOD基因；载体表达；转染；骨髓间充质干细胞分类号：R743．34TT万方数据ResearchonMSCstransfectedwithECSODgenefor

7、AbstracttreatmentoliSCilemICstrokein量‘ats··⋯’●·’●1hPartIConstructionofECSODgeneexpressionvectorsandECSODgeneinvitrotransfectionbonemarrowmesenchymalstemcellObjective：AfterECSODgeneexpressionvectorswereconstructed，extracellularsuperoxidedismutasc(ECSOD)gene，packagedbylentiviru

8、s，transfectbonemarrowmesenchymalstemcell(MSCs)ofmaleSprague—Dawley(’