crispr-cas9技术的发展与应用

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1、.CRISPR/Cas9技术的发展与应用Zujia.W摘要：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins,CRISPR/Cas)技术是近两年出现的一种定点基因组编辑新工具，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。这种新的基因编辑工具的出现，为基因功能、疾病分子机制的研究带来了便利,并且在研究和使用过程中不断创新发展，扩大了其应用范围。关键词：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短

2、回文重复序列关联蛋白基因编辑转录调控基因治疗ABSTRACT:Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins(CRISPR/Cas)hasbeendevelopedasanewtargetedgenomeeditingtoolsincethelast2years.Becauseit'sflexible,efficient,cheapandeasytooperate,itquicklysurpasstheprevioustechnologiesto

3、becomethehottestgenomeeditingtool.Theemergenceofthisnewgeneeditingtoolhavebroughtgreatconvenienceforresearcheringenefunction,molecularmechanismsof...disease.Intheprocessofresearchanduse,thistechnologyisgoingthroughcontinuousinnovationanddevelopment,expandingitsscopeofapplication.

4、Keywords:CRISPR/Casgenomeedtingtranscriptionregulationgenetherapy基因编辑技术指采用一定的方法技术对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的的突变，敲除、插入等改变。基因编辑技术主要包括：化学和UV诱导的基因突变；DNA重组酶介导的基因置换；锌指酶（ZFNs）和类转录激活效应因子核酸酶（TALENs）基因编辑系统，以及2013年问世的以gRNA为向导的CRISPR/Cas系统[1]。CRISPR/Cas系统的组成CRISPR/Cas系统最初在细菌中被发现，是细菌体内重要的适应性免疫的结构

5、基础，帮助细菌抵抗病毒和噬菌体。细菌体内的CRISPR/Cas系统包括介导DNA识别的CRISPRRNA(crRNA)，和介导DNA切割的Cas核酸酶。典型的CRISPR基因主要由Cas基因家族和CRISPR序列原件构成。CRISPR序列是高度保守的一段序列，由严格保守的21-48bp的重复序列（repeats）和高度可变的间隔物序列（Spacers）交相间隔组成。...CRISPR基因的典型结构目前，主要鉴定发现了三种CRISPR/Cas系统，而TypeⅡ是最常见最常用的一种CRISPR/Cas系统，该系统发挥作用只需要一种Cas蛋白——Cas9。通过

6、晶体结构分析发现[2]，Cas9蛋白主要包含有两个结构域，分别是发挥识别功能的REC结构域，发挥剪切功能的NUC结构域。其中NUC结构域又由RuvC,HNH和PAM-interacting(PI)组成，当RuvC和HNH同时发挥切割作用时，就可以形成DNA的双链断裂（DSB）。CRISPR/Cas9技术的发展利用CRISPR/Cas9技术，通过设计特异性的sgRNA，可以实现特异性的DNA识别，并且在靶向位置完成切割，再通过细胞本身的DNA修复机制，完成断裂处的修复，从而实现目标基因的“编辑”。随着CRISPR/Cas9技术的广泛应用和研究的深入，从经典

7、的CRISPR/Cas9技术中也衍生出了各种更为精准有效的应用技术。通过修饰改变Cas9的功能结构域，完成了对CRISPR/Cas9...技术的一次次创新。一．Cas9切口酶（Cas9nikase,Cas9n）将Cas9蛋白的NUC结构域（切割域）中RuvC或HNH任意一个切割结构位点诱导突变，使其失去切割DNA的活性，这样的Cas9蛋白就称为Cas9切口酶（Cas9nikase,Cas9n）。Cas9n由于其中一个切割活性位点发生突变，就不能完成DNA的双链切割，只能切割DNA的一条链，形成单链断裂（SSB）。如果将Cas9n和两条不同的sgRNA联合

8、使用，就可以形成交错的双链断裂（DSB），再激活DNA的修复机制。这种断裂方式能