两种虹彩病毒isknv和tfv的细胞感染研究

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1、中山大学硕士学位论文两种虹彩病毒ISKNV和TFV的细胞感染研究姓名：石秀娟申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：何建国20070607石秀娟中山大学硕士学位论文两种虹彩病毒ISKNVjI；gTFV的细胞感染研究水生生物学硕士生；石秀娟导师：何建国教授中文摘要传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)是重要养殖鱼类鳜鱼(Sinipercachuatsf)暴发性流行病的病原，为虹彩病毒科(Iridoviddae)，细胞肿大病毒

2、属(Megalocytivirus)的代表种。虎纹蛙病毒(tigerfrogvirus，TFV)是使养殖虎纹蛙蝌蚪(Ranatigrinarugulosa)和中华鳖(Trionyxsinensis)发病致死的主要病原，属于虹彩病毒科，蛙病毒属(Ranavirus)。本研究用ISKNV对本实验室现有鱼类细胞系进行了敏感细胞系筛查，结果没有找到可感染ISKNV的细胞系。基于此，开展了鳜鱼多种组织及仔鱼的原代细胞培养工作。其中鳜鱼心脏和脑的原代细胞在传代至9代左右时无法继续维持；鳍条细胞(MF)可传代至

3、13代，无法继续培养；肾细胞(MK)生长情况良好，可传代培养至13代左右；鳜鱼仔鱼细胞(M_Fry)在传至30余代后仍保持良好状态，存活一年多，营养条件及培养环境基本稳定，有望建立成熟细胞系。通过ISKNV攻毒实验，发现M-Fry、涨和MF在感染ISKNV后均可以出现细胞病理变化(cytopathogniceffect，CPE)，但并非典型的病毒空斑现象。逆转录PCR结果证实该病毒确实在这三种细胞中发生转录。通过电子显微镜观察只在M—Fry细胞内发现有二十面体结构的ISENV病毒粒子。利用对ISK

4、NV敏感的M-Fry细胞，进行病毒部分基因的转录分析，获得ISKNV部分基因表达时相的同时，也证实M—Fry细胞可作为ISKNV全基因组转录时相分析的有力工具，为ISKNV全部ORF的划分、聚类提供更多实验依据。TFv病毒已知其有多种鱼类敏感细胞系。由于斑马鱼胚胎细胞系ZF4的建立使其成为体外及细胞水平研究的有力工具，本论文进行了TFV对ZF4的感染实验。研究发现ZF4细胞在感染TFV之后会出现典型的CPE，并且通过透射电镜观察到在ZF4石秀娟中山大学硕士学位论文细胞内晶格状整齐排列的TFV病毒粒

5、子以及通过出芽方式正在释放中的病毒；另外逆转录PcR及免疫荧光实验证实该病毒确实在ZF4细胞中发生转录及蛋白合成。本研究为今后将模式动物一斑马鱼引入鱼类虹彩病毒的研究中奠定了基础。关键词：ISKNV，TFV，原代细胞培养，病毒感染，ZF4，电子显微镜，逆转录PCR，免疫荧光II互墨塑±些查堂堡圭兰垡堡窭——VirusSusceptibilitystudiesOHtwotypesofiridovirusesISKNVandTFViri0Van113删HydrobiologyName：ShiXiuju

6、anSupervisor：Prof．HeJianguoABSTRACTInfectiousspleenandkidneyneurosisvirus(Isl心rv)belongstothegenusMegalocytivirusofthefamilyIridoviridae．IthadresultedinsignificanteconomiclossoftheimportantculturedSinipercachuatsi．Tigerfrogvirus(TFV)belongstothegenusR

7、anavirusofthefamilyIridoviridae．ItisidentifiedasthemainpathogenoftadpoleofRanatigrinarugulosaandTrionyxsmens括，causedmassmortalitiesinChina．ForISKNV,therewerenosusceptiblecelllinestothisvirus，wedoaworkdevelopingnewcellculturesystemswhichareinitiatedbye

8、xplanttechniqueusingdifferenttissuesofSinipercachua坫i．Primaryculturesincludethefrycells，kidneycells，fincells，muscleceilsandbraincells．Onlythefrycells，kidneycellsandfincellscanbesubcultured，andthefrycellshavebeenfoundgrowwellforayear，andbeensub