反向遗传构建a组轮状病毒重配毒株的研究

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1、华中师范大学硕士学位论文反向遗传构建A组轮状病毒重配毒株的研究姓名：白萱申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：杨继红20080501硕士学位论文MASTER’STHESIS中文摘要轮状病毒(Ibtavims，RV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属；已被确认为引起全世界婴幼儿急性胃肠炎最常见的病原。轮状病毒感染每年导致全球约1．25亿婴幼儿发生腹泻，轮状病毒腹泻每年造成全球90万5岁以下婴幼儿死亡，严重影响了婴幼儿的健康并给全球带来巨大的疾病负担。轮状病毒引起的腹泻至今尚无特效药物进行治疗，疫苗是目前证实唯一最有效的预防方法。本论文研究内容包括A组轮状病毒(G触W)武汉地区G9型

2、流行毒株CC．1的分离及Vp7基因的克隆与分析；A组轮状病毒vp7基因转录载体的构建与检测；A组轮状病毒重配株的构建。具体内容如下：第一章全面概述了轮状病毒的形态结构、理化性质、基因组结构及编码的蛋白质、体外培养、以及A组轮状病毒的流行病学、轮状病毒疫苗研究现状，重点论述了G9型轮状病毒的流行特征及轮状病毒的反向遗传学研究。第二章武汉地区G9型轮状病毒的分离和、rp7基因的克隆与序列分析采用MAl04细胞从粪便样本中分离Cc．1株，ImPCR获得、，p7基因，并克隆至pGEMT-e弱y载体，获得质粒pGEM、，p7．G9。对质粒插入片断测序并进行序列分析。第三章A组轮状病毒全长v

3、p7基因转录载体的构建与检测。采用overl印PCR方法构建5’端上游有T7．RNA聚合酶启动子、下游有HDV核酶序列与T7一RNA聚合酶终止子的Vp7基因，构建、，p7转录载体pGEM、rp7一I也。该质粒转染预先感染vTF7．3的哺乳动物细胞后，在哺乳动物细胞中获得具有正确的正确5’与3’末端的vp7+sRNA。第四章反向遗传学方法构建A组轮状病毒重配株。采用补骨质素一紫外线A使重组痘病毒vTF7．3失去感染性，但仍保持表达T7．RNA聚合酶的活性。将重组痘病毒vTF7．3感染Ve∞细胞，采用G1型A组轮状病毒、，p7的全长6NDA转录载体转染感染了vTF7．3的Ver0细胞

4、，在细胞内获得具有正确5’与3’端的轮状病毒、，p7基因+s鼢队。然后将另一株GlO型A组轮状病毒感染轮状病毒敏感的、，p7细胞，在病毒的包装过程中vp7发生重配。然后使用单克隆抗体对重配病毒进行筛选。关键词：轮状病毒；vp7；G9型；全长c聊姒；基因重配；反向遗传硕士学位论文MAS下ER’STHESrSAbstractRo协Vinls，onegenerabelongstonlef．amilyRPDVD，．Z砌P，knownaSmem越ncauseofseVere，dehydratingdi撕heaininf．雒tSaIldyoungchildrlen．RotavinJsises

5、timatedtocausedbout125IIlillioncausesofdiamleaan玎l】2dly，and也erotavns—relateddiarrheacause900ⅡlousaIldsde础sini玎fantsuIlder5yearSold．SinCetherel刖ebeelln0speciaJlygoodef．fectremedy，tlledeVelopmentaIlduniVersaluseofasafeaIlde毹ctiVeVaCcineisconSideredaSthe丘rststral-eg)rforpreVention．111js咖dyinclud

6、es：IS0lationofro诅VimsgroupAStrainCC一1detectedinWuhaIl丽thG9genot)，pea11d．Tlleresea]rchcontentsaI-easf．ollows：Chapterone：AbriefreViewofR0taVimsoft11e劬damentalresearchesonVirons协Jcture，physicochemicalproperties，genenome2ulditscodiIlgproteiIls，cultllremetllods，印idemi0109y锄dVaccilledevelopment，wtl

7、ichfocIIseson也c印iden拍lo西cc㈣sticsofG9RvaIldmereVersegeneticsresearChonro伽iruS．ChapterTwo：IsolationofGARVwitllG9serotypedetectedinWllllall；Sequenceandp11logenetic锄alySisof、，p7gene．Ah啪a11铲oupAro伽iIuSstrainCC一1诵mG9serot=憎especific毋waSisolatediIlM