合浦珠母贝微卫星dna标记分离与遗传多样性研究

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1、华中农业人学2008屈硕'J：学位论文第1章文献综述1合浦珠母贝简介及其研究现状1．1合浦珠母贝简介合浦珠母贝(Pinctadafucata)又称马氏珠母贝，隶属于珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属(Pinctada)，主要分布于我国广东、广西、海南、日本、印度以及澳大利亚沿海，是世界上用于生产海水珍珠的最主要贝类，所产珍珠即为历史悠久、闻名遐迩的南珠。除产珠外，贝肉可鲜食，肉味极佳，珍珠是名贵装饰品，贝壳可加工成珍珠粉，入药治病，因此合浦珠母贝具有重要的经济价值。1．2合浦珠母贝研究现状1．2．1国内研究现状国内以前关于合浦珠母贝的研究主

2、要集中在人工繁殖(张国范，1984；蒙钊美等，1996)、插核育珠(蒙钊美，1983)、幼贝摄食(黎辉等，1997)、遗传育种(王爱民等，2003a)、精子生物学(喻达辉等，1998，1999a，1999b，1999c)、病害防治方面(姜卫国，1984)。近年来，随着分子生物学技术的发展，也有很多学者开展了合浦珠母贝分子生物学方面的研究，喻达辉和朱嘉濠(2005)对中国、日本和澳大利亚合浦珠母贝的1TS2序列特征进行了分析，结果表明3个地理种群内和种群间的遗传距离都较小，且相互重叠，从基因型数据看，3个群体既有各自独立的基因型，也有共享基因型。但3个群体没有各自独有的突变位点，

3、说明3个地理种群既具有丰富的遗传多样性，又具有高度的遗传一致性，即亲缘关系很近。苏天凤等(2002)利用RAPD技术检测了不同地理种群合浦珠母贝基因组DNA的多样性，结果表明，广西种群与广东种群的亲缘关系较近，而与海南种群亲缘关系较远。杜晓东等(2000)曾利用RAPD标记对合浦珠母贝基因组DNA的多态性进行了分析。王爱民等(2003b)运用RAPD技术研究表明，合浦珠母贝不同地理种群间杂交能够增加子代的遗传多态性。YuandChu(2006)用AFLP技术研究了我国大亚湾、北部湾、三亚以及日本和澳大利亚5个不同地理种群的合浦珠母贝的遗传差异，产生的多态性比较高(91．8．97

4、．3％)，群体间的遗传分化较低(GsT：0．0079—0．0404)。凌立等(2006)对合浦珠母贝B一2肌动蛋白基因进行了克隆和序列分析，通过RT．PCR方法克隆鉴定了合曲妮妮：合浦珠母儿微一卫星DNA标记分离oj遗传多样性研究浦珠母贝肌动蛋白同源基因片段，序列分析表明，该片段编码的氨基酸序列与相应同源片段具有较高的保守性。黄桂菊等(2007)进行了合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析，获得cDNA全长序歹lJ2365bp，同源性分析表明，合浦珠母贝hsp70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostreagigas)等双壳贝类的相似性高达86％以上。佟广香等(

5、2007)用磁珠富集法进行了马氏珠母贝的微卫星分离研究，得到8个多态位点。1．2．2国外研究现状国外对于合浦珠母贝的研究较多的是日本。他们除了人工繁殖和插核育珠方面的研究外，还较早的开展了人工选育方面的研究(wadaandKomaru，1990，1994a，1994b)。在微卫星分离及遗传多样性方面，Evansetal(2006)进行了大珠母贝基因组微卫星分离研究，得到6个多态标记；Herbingeretal(2006)进行了珠母贝的基因组微卫星分离研究，得到10个多态标记。2微卫星分子标记的分离方法自1989年微卫星标记报道以来(LittandLuty，1989；Tautz，

6、1989；WeberandMay，1989)，由于其高度多态性和共显性特点，得到广泛应用，其分离技术也得到不断的改进，常见的分离方法有以下几种。2．1小片段DNA克隆法小片段DNA克隆法(smallDNAfragmentscloning)的基本原理是构建目标生物基因组小片段DNA文库，通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆。首先用限制性内切酶充分消化DNA，琼脂糖凝胶电泳，选取400—900bp片段克隆，构建基因组文库。然后将重组克隆转移到杂交膜上，采用P32标记的重复序列探针如(AT)。进行杂交，放射自显影，获得阳性克隆、测序，设计PCR弓]物并进行扩增筛选。鲁翠云等(200

7、5)利用上述方法从鳙鱼文库中筛选6000个菌落，获得阳性克隆99个，75个含有微卫星序列。2．2富集文库法2．2．1引物延伸富集法引物延伸富集法就是将酶切后的DNA选择片段重组入噬菌体载体中，建立单链DNA文库，然后以单链DNA为模板，含微卫星序列的寡核苷酸为PCRiJJ物，进行引2华中农业大学2008届硕L学位论文物伸长反应，获得富含目标微卫星的双链产物。利用此方法，SekinoandSara(2001a，2003)相继分离了日本盘鲍(Haliotisdiscusdiscus)和太平洋牡蛎