吡非尼酮对大鼠肝纤维化rhoa表达的影响

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1、贵阳医学院2013届研究生学位论文《中国图书资料分类法》分类号：R34单位代码：10660学号：S100480贵阳医学院2013届临床医学硕士专业学位材料(临床论文部分)吡非尼酮对大鼠肝纤维化RhoA表达的影响（保密时间：2013年6月-2014年6月）研究生：田瑞卿导师：周石教授年级：2010级专业：影像医学与核医学2013年5月9日贵阳医学院2013届研究生学位论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„1略缩词表„„„„„„„„„„„„„3前言„„„„„„„„„„„„„„5材料与方法„„„„„„„„„„„„7结果„„„„„„„„„„„„„

2、„18讨论„„„„„„„„„„„„„„22参考文献„„„„„„„„„„„„„25致谢„„„„„„„„„„„„„„29英文摘要„„„„„„„„„„„„„30论文原创性声明„„„„„„„„„„34综述„„„„„„„„„„„„„„35附：临床能力考核有关材料：临床轮转考核表(按时间顺序)学术活动情况表(按时间顺序)临床能力考试及学位答辩情况表贵阳医学院2013届研究生学位论文吡非尼酮对大鼠肝纤维化中RhoA表达的影响硕士研究生：田瑞卿导师：周石（教授）专业：影像医学与核医学中文摘要肝脏纤维化(hepaticfibrosis，HF)是指因过多的细胞

3、外基质成分和成纤维细胞聚集而导致正常肝脏组织结构改变和功能丧失的一类疾病。该病理生理变化主要为细胞外基质（extracellularmatrixc.ECM）异常堆积和ECM成分发生重新分布，进而引起纤维结缔组织的增生，正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，最[1-2]终可发展为肝硬化、肝癌。在HF发生发展过程中，肝星状细胞（Hepatic[3-4]stellatecells.HSC）的激活和增殖是纤维化过程中最关键的因素。因此积极研究肝星状细胞激活和凋亡过程及相关因素，找到HSC活化和凋亡的靶点，逆转纤维化进展中的中心环节，寻找有效的治疗HF药物

4、，对HF相关疾病的防治理论与临床治疗都具有重大意义。Rho（Rashomologue，三磷酸鸟苷酶）蛋白属小G超蛋白家族的亚家庭成员，根据其序列的同源程度和功能不同，可将其分为RhoA，Rac1，Cdc42和缺乏GTP[5-7]酶活性四大类。RhoA（Ras同源基因家族，成员A）是一种鸟苷酸结合蛋白，也是目前已知的一种能调节肌动蛋白细胞骨架、细胞形态异质性及细胞运动性的重要细胞因子，同时还是Rho/Rho激酶信号传导通路中的主要信号分子。目前研究发现激活后的RhoA还能影响更多生物学行为，包括细胞骨架的组装、转录因子的激活、细胞周期的调节等

5、，而这些都与纤维化发展过程密切相关。因此作者猜测，研究HF过程中RhoA的表达及其影响因素，将会为抗纤维化治疗提供新的思路。吡非尼酮（pirfenidone，PFD），是20世纪70年代末合成的小分子化合物，最初的研究发现PFD具有一定的抗炎作用，随着研究的进展，越来越多的结果证实其对肺、肾、心脏、皮肤等组织器官纤维化也具有一定的治疗作用。作为一种广谱抗纤维化药物，吡非尼酮对肺纤维化的治疗效果尤为显著，而近年来的一些1贵阳医学院2013届研究生学位论文[8]研究证实其对肝脏纤维化也有较好的治疗作用。HSC-T6由SV40-T6抗原转染原代大

6、鼠肝星状细胞而来，其表达Desmin（肌细胞纤维蛋白）和α-SMA（成纤维细胞中平滑肌肌动蛋白α），具有活化HSC[9]的特征，因此常用于实验研究肝纤维化发生、转归过程及影响机制。本论文研究以体外培养的大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）为实验模型，通过观察吡非尼酮对其作用后，肝星状细胞形态学及增殖的变化、RhoA的表达和活性改变，旨在研究RhoA在肝纤维化形成过程中的表达及作用机制，进而探讨肝纤[10-11]维化相关疾病的预防及治疗。1、研究目的：本实验主要研究吡非尼酮作用于活化的大鼠肝星状细胞株后，广谱抗纤维化药物吡非尼酮对HSC-T6形态

7、及数目、细胞增殖、RhoA表达及活性的影响，从而进一步探讨PFD抗肝纤维化的作用机制。2、研究方法：2.1细胞培养；2.2台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率；2.3吡非尼酮作用于HSC-T6后，倒置显微镜下定时观察细胞形态的变化；2.4CCK-8法检测细胞增殖的变化；2.5免疫印迹法（WesternBlot）检测吡非尼酮对RhoA蛋白表达的影响；2.6用Quantity-one凝胶成像分析系统分析各条带的总灰度值，并与其相对应的内参(GAPDH)的总灰度值相比较，得出灰度比值进行定量统计分析。统计分析采用SPSS17.0软件进行分析；3、研究结果：

8、3.1细胞形态定时用倒置显微镜下观察培养的HSC-T6细胞株，未经吡非尼酮处理的肝星状细胞形态多不规则，多数呈多角形、圆形或带伪足的星形。吡非尼酮（100ug/ml,500ug/