nusap1在肝细胞癌中的表达及其与肝细胞癌复发的关系

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1、南方医科大学2010级博士学位论文NuSAPl在肝细胞癌中的表达及其与肝细胞癌复发的关系ExpressionsofNuSAPIinHepatocellularCarcinomaandItsCorrelationswithHepatocellularCarcinomaRecurrence课题来源：广东省自然科学基金资助项目(基金号：10151051501000120)学位申请人张猛导师姓名杨定华专业名称临床医学培养类型专业学位培养层次博士所在学院南方医科大学2013年3月30日广州博士学位论文NuSAPl在nT-幺$胞癌中的表达及其与肝细胞背景癌复发的关系2010级肝胆外科在职博士：张猛指导

2、教师：杨定华教授摘要肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是常见、高发的恶性肿瘤之一，肝细胞癌术后的高复发率成为影响其生存率和预后的最主要因素之一。但其根本的病因及机制尚不明了。深入研究原发性肝癌发生、发展的分子生物学基础，及早预测原发性肝癌复发的危险性，从而有效改善原发性肝癌病人的预后，在当前有着非常重要的现实意义。核仁纺锤体相关蛋白1(nucleolarspindle—associatedproteinl，NuSAPl)是一种微管合蛋白，在纺锤体组装中发挥重要功能，是保证细胞周期正常进行的重要调控分子。NuSAPI的mRNA水平和蛋白水平受到严格的调控，在细

3、胞周期进程中呈现周期性变化。转录因子E2F家族在控制细胞周期的进展中起关键作用，NuSAPl基因的启动子区域含有E2F的结合位点，E2F1和E2F结合位点结合后可明显促进NuSAPl的转录。近年来研究发现在许多其它肿瘤中存在NuSAPl的过表达，它们的表达水平往往和肿瘤的侵袭性及预后有关。有关NuSAP!在原发性肝癌发生发展中的作用以及与肿瘤侵袭性、预后的关系还没有相关的报道。目的鉴于NuSAPI家族在细胞周期中的重要作用，其功能的紊乱与肿瘤的发生发摘要展及转移复发可能存在着密切关系，本实验将从细胞水平和组织水平研究NuSAPl在肝细胞癌中的表达，分析NuSAPI在肝细胞癌中表达的临床意义

4、及其与E2F1的关系，探讨NuSAPl在肝细胞癌的发生、发展和复发转移过程中的作用及其分子机制。方法(I)．收集手术切除的新鲜肝细胞癌组织和相应的非癌组织标本，采用RT-PCR、荧光定量PCR检测癌和非癌组织标本中NuSAPl的mRNA表达水平，免疫组织化学染色检测癌和非癌组织标本中NuSAPl、E2F1蛋白表达水平，分别分析NuSAPl、E2F1在肝细胞癌中的表达与相关临床病理特征及预后的关系；并探讨E2FI在肝细胞癌中的表达及其与NuSAPI表达的关系。(II)．采用人高转移肝细胞癌细胞株HCCLM3，利用SiRNA定向抑制NuSAPl的表达，采用荧光定量PCR方法检测抑制前后HCCL

5、M3细胞株中NuSAPlmRNA表达的变化；采用Westernblotting方法检测抑制前后HCCLM3细胞株中NuSAPl蛋白表达的变化；使用Freshney计数板计量细胞数目的变化；MTS和Edu法检测细胞增殖活性的变化；transwell小室检测细胞迁移能力和细胞侵袭能力的变化；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化：分析其表达对肝细胞癌细胞生物学特性的影响；(III)．采用人高转移肝细胞癌细胞株MHCC97H，利用SiRNA定向抑制E2F1的表达；采用荧光定量PCR方法检测抑制前后MHCC97H细胞株中NuSAPlmRNA表达的变化；采用Westemblotting方法检测抑制前后M

6、HCC97H细胞株中NuSAPl蛋白表达的变化；研究在肝细胞癌细胞株中E2F1的表达对NuSAPl表达的调节作用。结果1．无论是核酸水平还是蛋白水平，NuSAPl在肝细胞癌组织中的表达均明显高于相应的非癌组织(P

7、存分析表明NuSAPl在肝细胞癌组织中的高表达与肝细胞癌患者预后差相关(X2=5．939，P=0．015)。肝细胞癌患者术后的无瘤生存期与NuSAPI蛋白表达的高低相关(Kaplan—Meier，log—ranktest，P<0．05)。2．E2F1蛋白在肝细胞癌组织中的表达明显升高(P<0．05)；肝细胞癌组织中的E2Fl蛋白表达升高与病理分化、早期复发、TNM分期及巴塞罗那分期相关伊<0．05)；生存分析表明E2F1