尿路致病性大肠杆菌外膜蛋白t的致病机理研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文尿路致病性大肠杆菌外膜蛋白T的致病机理研究RolesofuropathogenicEscherichiacolioutermembraneproteinTinpathogenesisofurinarytractinfection课题来源：国家自然科学基金项目(30972637)学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人屈娅荣名曹虹教授称病原生物学型学术型次硕士研究生院公共卫生与热带医学学院答辩委员会主席彭涛研究员答辩委员会委员江振友教授芮勇宇教授赵卫教授吴英松教授2013年

2、4月30日广州硕士学位论文IHilillllillililiiHiilJ／fiY2405749尿路致病性大肠杆菌外膜蛋白T的致病机理研究硕士研究生：屈娅荣指导教师：曹虹教授摘要一、研究背景和目的尿路感染(晌arytractiafcction，UTI)，简称尿感，是指病原体侵入尿路粘膜或组织引起的尿路炎症。根据感染部位，尿路感染可分为下尿路感染和上尿路感染，前者主要为膀胱炎，后者为肾盂肾炎，肾盂肾炎又可分为急性和慢性。根据Hodson标准【lJ，急性肾盂肾炎是细菌入侵肾脏，引起急性间质肾小管炎；而慢性肾盂肾

3、炎，又有静脉肾盂造影典型肾盂肾炎的影像学表现。根据有无基础疾病，尿路感染还可分为复杂性尿感和非复杂性尿感。UTIs可以发生在任何年龄，男性的发病率约为0．3％，而在65岁以后，由于前列腺疾病和泌尿外科手术，其发病迅速增加到13％～14％【21。由于女性的特殊生理构造，女性比男性更易感，据统计，大约有81％的UTIs发生在女性，年龄在16到35岁之间，其中27％女性在初次尿路感染后半年内复发，约有48％的女性一年内受到UTIs复发的困扰。尿路感染是临床最为常见的细菌感染之一，目前治疗主要以使用抗生素为主，由

4、于致病菌临床的耐药性越来越强，使其容易反复发作。反复发作的尿路感染不仅使病人遭受痛苦也在全球造成很大的医疗和经济负担。大部分尿路致病菌都起源于肠道，经尿道上行至膀胱。约95％的W'ns的起始感染部位是膀胱，在尿路感染中，由尿路致病性大肠杆菌(Uropamogeme蜘ch／aco／／，UPEC)弓I起的UTIs占800／0"、9C％。目前主要的研究工作是围绕UPEC展开的。中文摘要绝大多数UPEC都携带ompT基因，其编码的外膜蛋白T(outermembraneproteinT，OmpT)是一种在变性溶液中

5、都具有很强活性的蛋白水解酶，因其引起外源表达蛋白的严重降解而引起关注。OmpT作为一种多活性蛋白酶，它是引起外源充足蛋白降解的重要的蛋白水解酶之一，在尿路感染中有重要的作用。其底物及切割位点的不同均可引起其作用活性的改变，OmpT主要识别水解由碱性氨基酸Arg和Lys残基组成的肽键。研究发现OmpT与鼠耶尔森杆菌Pla有47％同源的性【3】。有研究证明Pla可以增强细菌黏附到细胞外基质并可以激活纤溶酶原转换为纤溶酶，促进细胞外基质的降解而致病的功能。OmpT是否也具有与细胞外基质相互作用影响尿路致病性大肠

6、杆菌的黏附侵袭而致病呢?本课题中，我们利用本实验室前期构建的尿路致病性大肠杆菌CFT073的ompT基因敲除株和回补株COTD(pST)，进行一系列实验研究。我们对ompT野生株CFT073和敲除株COTD对体外细胞模型和对细胞外基质的黏附情况进行考察。通过建立人膀胱癌移行上皮细胞5637细胞模型，并提取细胞外基质，考察OmpT与细胞外基质相互作用的情况。结果发现与野生株CFT073相比敲除株COTD的黏附率明显降低，推测OmpT可能会增强致病菌对细胞外基质的黏附能力，为后续的降解细胞外基质，促进细菌进入

7、胞内打下基础。流行病学分析表明，多数UPEC中的ompT与切，懈、cnfl、sfa、prf,iha、iroN等基因密切相关，研究表明ompT与这些毒力基因在遗传学上并非紧密连接，推测其功能与这些毒力基因的相互调控相关14J。由于基因的表达调控不是单一的、孤立的，而是彼此联系，相互制约的，构成了复杂的基因表达调控网络。几乎所有的细胞活动和功能都受基因网络调控，独立的研究单个基因及其表达几乎完全不可能确切的反应生命现象本身和内在规律。所以我们在本研究中通过荧光定量PCR方法分析ompT基因与细菌主要黏附毒力基

8、因iha和毒力基因iroN的关系，明确OmpT是否在调控毒力基因的表达中起到一定的作用。同时我们通过建立小鼠急性尿路感染的动物模型，比较野生株CFT073与ompT基因缺失株COTD所致尿路感染小鼠的泌尿器官的病理改变的差异，比较产生菌血症的差异和膀胱和肾脏组织中的细菌组织载量的不同，考察OmpT在II硕士学位论文致炎过程中的作用。其次，我们采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoadsordentassa