检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的elisa方法的建立

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1、检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的ELISA方法的建立EstablishmentofELISAsfordetectingantibodyorantigenofduckreovirus(DRV)thatcausingduckegglayingdrop、、／一⋯一一研究生：孙陈莉专业：预防兽医学导师：吴艳涛教授扬州大学兽医学院2013年6月孙陈莉：检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的ELISA方法的建立检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的ELIsA方法的建立I愀黜研究生：孙陈莉‘一一一一一一导师：吴艳涛教授摘要呼肠

2、孤病毒感染可引起鸭的以头颈肿胀、眼结膜充血(出血)、全身皮肤广泛出血等为主要特征的传染病，被国内外视为危害养鸭业健康发展的重要疫病之一。2010年起，我国南方地区蛋鸭中陆续发生临床主要表现为产蛋下降的传染性疾病，本实验室从发病鸭群中分离、鉴定了呼肠孤病毒。为了对致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒(duckreovirus，DRV)进行诊断和防控，本研究分别建立了检测DRV抗原和抗体的方法，包括两个方面：一是以大肠杆菌表达的DRV6B蛋白作为包被抗原，建立检测DRV抗体的间接ELISA方法；二是研制针对DRV的单克隆抗体，建立检测DRV

3、抗原的双抗体夹心ELISA(DAS．ELISA)方法。采用RT-PCR扩增DRVZY／AH／1／2011株的oB基因，克隆到原核表达载体pET-32a(+)，再转化大肠杆菌Transetta(DE3)。含有重组质粒pET-cB的大肠杆菌经IPTG诱导，获得大小为55ku的以包涵体形式表达的重组oB蛋白。Westem．blotting显示重组oB蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI-NTA树脂在变性条件下纯化重组cB蛋白，并用梯度尿素复性。将纯化的重组aB蛋白作为包被抗原，建立了检测鸭血清中DRV抗体的间接EL

4、ISA方法。以该方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测，两者的符合率为100％。该方法与鸭瘟病毒、雏鸭肝炎病毒和禽流感病毒的阳性血清均无交叉反应，批内变异系数小于11％、批问变异系数小于14％。采用差速离心和蔗糖密度梯度超速离心提纯DRVZY／AH／1／2011，将其作为抗原免疫8周龄BALB／c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2／0进行细胞融合。以纯化的重组cB蛋白作为检测抗原筛选阳性克隆，经有限稀释法亚克隆3～4次，获得了6株稳定分泌抗DRV单克隆抗体的杂交瘤细胞，依次命名为：2D7、2D10、2811

5、、682、4D7、7H9。经鉴定单抗效价达l：1600-1：51200；其中单抗2D10的亚类为IgGl、其余5株单抗的亚类为IgG3；间接免疫荧光试验显示6株单抗与感染DRV的Vero细胞产生特异性反应；Western．blotting显示6株单抗能够与重组aB蛋白特异性结合；单抗2D10与682、4D7可能识别不同的抗扬州大学硕士学位论文原决定簇。分别以ProteinG树脂纯化的DRV兔多抗血清和2D10单抗为捕获抗体和检测抗体，建立了检测DRV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS．ELISA)方法。该检测方法的敏感性达O

6、．522gg／mL，与鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒均无交叉反应，批内和批间变异系数均小于10％。上述结果表明，本研究建立的检测致产蛋下降DRV的抗原或抗体方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。关键词：鸭呼肠孤病毒；原核表达；间接ELISA；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA孙陈莉：检测致产蛋下降的鸭呼肠孤病毒抗原或抗体的ELISA方法的建立EstablishmentofELISAsfordetectingantibodyorantigenofduckreovirus(DRV)thatcausingduckegglay

7、ingdrop、，一⋯一一M．S．Candidate：SunChen—liAdvisor：Prof．WUYan．taoAbstractTheinfectionofreoviruscouldcausecontagiousdiseasethatwascharacterizedbyswellingnape，eyeconjunctivalcongestionorbleedingandextensivehemorrhageofinfectedducks．Since2010，avirulencecontagiousdiseaseemer

8、gedinsuccessiononegglayingducksinthesouthernpartofourcountry，anditwascharacterizedbyegglayingdrop．Reoviruswasisolatedandidentifiedfromtheilledduc