苹果突触小泡膜蛋白基因mdvamp的克隆和表达分析

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1、万方数据“l●一‘一CloningandexpressionanalysisofasynaptobrevinproteingeneMdVAMPfromapple(MalusdomesticaBorkh·)ThesissubmittedtoQ芗ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofAgronomyChenJingjing(DepartmentofHorticulture)Supervisor：YuanYongbingQingdao．Ch

2、inaJune，2013㈣幽万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：葭京菁帆加年占月捃日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制

3、手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名：豫隶丰函蚴时间：加f；年‘月伊时间：劢B年6月腭日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要苹果突触小泡膜蛋白基因MdVAMP的克隆和表达分析摘要苹果(MalusdomesticaBorkh．)是世界经济最重要的水果之一，‘富士’是中国的主栽品种。果实色泽是苹果重要的外观品质，直接决定其商品和营养价值。果实果皮的红色主要由花青苷的含量决定的，由于花青苷的含量和分布不同，富士苹果的果皮呈现条红和片红两

4、种着色类型。花青苷是由一系列酶促反应生成的类黄酮类化合物。合成在细胞质中，积累于组织细胞的液泡中，其运输机制尚不清楚。本研究以‘富士’苹果及其浓红型芽变为试材，从果皮中克隆到花青苷运输相关基因MdVAMP基因的eDNA全长和gDNA全长序列。通过RT-PCR对‘富士’苹果及其浓红型突变体果实各时期和各部位进行MdVAMP基因的表达分析。构建该基因的原核表达载体和植物表达载体。具体结果如下：1．以‘富士’浓红型突变体果皮总RNA为模板，通过RACE克隆得到MdVAMP基因cDNA全长序列，GenBank登录号为KC222029。序列分析结果表明，MdVA

5、MP基因全长994bp，开放阅读框660bp，编码214个氨基酸，拥有Synaptobrevin和Longin保守区域。其氨基酸序列与沙梨、蓖麻、玉米等已知植物的synaptophysin基因的氨基酸序列的相似性在67％98％之间。2．利用MdVAMP基因保守序列设计引物，扩增到了MdVAMP基因的gDNA全长序列。片段长度为3604bp，编码1201个氨基酸，为以后获得基因启动子准备了条件。3．利用实时荧光定量PC财走术检测埘助脚基因在不同时期的富士苹果及其浓红型突变体的表达水平，结果表明：在‘富士’苹果及其浓红型突变体果实着色中期，MdVAMP基因

6、均有一个表达高峰，其余时期的基因表达量相差不大，且均低于该时期，但在突变体中后期有一定的增加。整个着色期间，浓红型突变体中的MdVA臌因表达量都高于富士品种，与花青苷积累呈正相关。4．对MdVA脚基因在嫩枝、叶片、花瓣、果皮及果肉五个部位的表达量进行分析，果皮中脚蹦脚基因的相对表达量最高，花瓣、果肉中的表达量次之，叶片、茎中的表达量最低，并且浓红型富士中基因的表达量明显高于普通富士品种，在茎和叶中则相反。说明该基因与花青苷的积累关系密切。5．在埘瑚御基因ORF两端引入BamHI和SacI酶切位点，以pBll21为植物表达载体，构建过量表达载体pBll2

7、1．MdVAMP；以pBll21一GFP为植物亚细胞定位表达1万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要载体，引入XbaI和BamHI构建苹果亚细胞定位表达载体pBll21．GFP．MdVAMP。重组载体pBll21-MdVAMP转化到农杆菌EHAl05。为验证苹果MdVAMP基因功能奠定了基础。6．构建重组载体pET41a．MdVAMP，将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)，SDS．PAGE结果显示，诱导表达得到大小约为54kDa的蛋白；诱导表达的最佳条件为：O．1mMIPTG，37。C诱导表达4h。为研究MdVAMP蛋白功能提供了条件。关键词：苹果

8、；膨助御；基因克隆；花青苷运输；苹果红色突变2万方数据青岛农业大学硕士学位论文J⋯l●_‘●■