蚊虫细胞与蚊虫组织中登革病毒受体分子筛选与鉴定

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文蚊虫细胞与蚊虫组织中登革病毒受体分子筛选与鉴定Screeningandidentificationofreceptorsofdenguevirusinmosquitocellsandtissues课题来源：国家自然基金项目(N0：30872198；30972566)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院潘京郑学礼病原生物学科研型研究生公共卫生与热带医学学院2013年5月日广州硕士毕业论文蚊虫细胞与蚊虫组织中登革病毒受体分子筛选与鉴定硕士研究生：潘京指导

2、老师：郑学礼教授摘要登革病毒是世界100多个国家尤其是热带和亚热带地区重要的虫媒传染病毒，近乎25．30亿人处在潜在感染登革病毒的危险中，每年估计有l亿的新增感染者，导致约24000人死亡。目前并无有效疫苗和抗病毒药物治疗。登革病毒属于黄热病毒属中的一个血清型亚群，登革病毒为单股正链RNA病毒，其病毒基因组编码三种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白及其前体M／prM、包膜蛋白E)和七种非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。主要由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播，有四种血清型

3、，其中Ⅱ型传播最广泛，各型病毒间抗原性有交叉，与乙脑病毒和西尼罗病毒也有部分抗原相同。病毒受体是由宿主基因组编码、控制和表达的一组蛋白质，它参与病毒与靶细胞的相互作用，使得病毒能够吸附于细胞表面。病毒在受体的介导下最终进入细胞进行复制。细胞上的病毒受体与病毒的宿主范围和组织嗜性密切相关登革病毒是世界范围的重要的虫媒传染病尽管经历了几十年的研究，然而登革病毒的复制周期还是未知的。登革病毒可以在多种昆虫和哺乳动物细胞培养中增殖，并引起培养细胞发生折光性增强、细胞变圆或细胞融合等不同程度的细胞病变。在哺

4、乳类细胞中的研究报道了大量细胞表面的登革病毒受体，其与细胞的种类和病毒的类型有关。哺乳动物的受体蛋白包括：细胞连接分子DC．SIGN(凝集素C受体)，37／67kDa高亲和层粘连蛋白受体，及热休克蛋白HSP70／90。摘要然而，昆虫细胞上的登革病毒受体并没有鉴定，主要的鉴定仅仅限制在分子量的大小上。然而目前大部分研究都没有区别是病毒连接分子还是作用分子，对于筛选出的分子与登革病毒的作用功能研究甚少。虫媒媒介效能与产生媒介感染的媒介屏障有关，主要包括中肠感染屏障(midgutinfectionbar

5、rier，MIB)、中肠逃逸屏障(midgutescapebarrier，MEB)、唾液腺播散屏障(salivaryglandstransmissionbarrier)。如果存在MIB，病毒就不能在蚊虫中肠细胞中感染或复制，这可能是由于细胞表面缺乏病毒受体。而MEB的存在，使病毒只能在中肠复制而不能播散，进一步感染二级靶器官。迄今为止，蚊传黄病毒与蚊虫中肠上皮细胞受体的相互作用机制还不十分清楚。本文在研究登革病毒受体的初选时，选用蚊虫的中肠组织作为主要研究对象，也是基于此媒介屏障的理论。在选用C6

6、／36细胞作为潜在登革病毒受体的筛选的载体，研究甚多，研究者利用VOPBA(virusoverlayproteinbindingassay)病毒覆盖蛋白结合试验，将提取的C6／36细胞膜蛋白通过SDS．PAGE分离，转到固体膜上，再将纯化的登革病毒覆盖结合蛋白，通过针对登革病毒的单抗识别结合的病毒间接筛选出特异性蛋白条带。该方法早期由M6xico等应用在白纹伊蚊系C6／36细胞中筛选登革II型病毒潜在受体，筛选出主要的分子为分子量约67000和80000的多肽。这为后来的登革受体研究在方法学上做了

7、初步的探索，至今研究筛选受体分子应用VOPBA作为初步筛选是较为理想的方法，国内外研究者外对此方法也不断改进，在登革病毒受体研究上取得很大进展，用上述方法Munoz等在C6／36细胞中鉴定出分子量67kDa和80kDa的两种蛋白为DV2的受体蛋白，尤其是分子量为67kDa的蛋白其多克隆抗体够抑制DV2连接感染C6／36。之后的研究建议把这两种蛋白作为四型登革病毒的受体蛋白。Chee等用VOPBA的方法筛选出分子量为48kDa的分子，之后第一次用质谱分析的方法鉴定出该分子为微管样蛋白，微管蛋白在最初

8、并不参与病毒内化作用，而是在后阶段的内化或是在搬运病毒颗粒发挥作用。在早期的研究中Salas．Benito等在C6／36细胞膜蛋白中鉴定出两种蛋白40kDa／45kDa，作为DV4的连接分子。并用亲和柱色谱法鉴定出这硕士毕业论文两种蛋白与重组登革病毒E蛋白相互作用，最终证明这两种蛋白为糖蛋白，尽管碳水化合物部分并未参与连接作用，之后的研究建议将该蛋白作为热休克蛋白(Hsp)90。通过抗体介导和小片段RNA介导的干扰下调抑制素基因的方法来确定抑制素介导病毒进入昆虫细胞的作用。发现抑制