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《长链非编码rna在骨肉瘤患者中的差异表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
博士学位论文中文摘要原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：斗届，、例学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：杯跏签 中文摘要长链非编码RNA在骨肉瘤患者中的差异表达研究目的：lncRNA在基因调控中起重要作用，目前它对骨肉瘤的发病机制的影响仍不清楚。本研究利用微矩阵基因芯片技术研究lncRNA在骨肉瘤和癌旁组织表达谱的差异并初步探讨其生物学作用。方法：分别取9例骨肉瘤癌组织和对照癌旁组织，提取总RNA后进行质量测定，合格后杂交合成cDNA后经过Microarray基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据，原始数据经过统计软件转换后进行统计分析，得到两种组织之间IncRNA和mRNA的差异表达谱。分别选取上调的IncRNA6个：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，下调的lncRNA4个：ASLNC00339，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNCl8814采用SYBRGREENI实时荧光定量聚合酶链反应(ImPCR)验证，并用GAPDH做内参。综合NCBIRefSeq，UCSC，RNAdb，LncRNAs等数据库资源，对芯片结果进行GeneOntology、Pathways分析等初步生物信息学分析，并通过计算Pearson相关系数(20．95)建立lncRNA与靶基因的基因网络图。结果：将差异表达的标准设为：Folgchange值>2，P值-<0．05，发现两种不同组织芯片表达有明显差异。骨肉瘤组织与对照癌旁组织相比，在检测的lncRNA表达谱中，9例样本平均上调的lncRNAs为n 博士学位论文中文摘要3528个(从2723到4537)，平均下调的lncRNAs为3958(从3469到4368)，其中在9例样本都上调的lncRNAs403个，都下调的IncRNAs798个，上调倍数最大的是ASLNC02724，7．23倍，下调倍数最大的是ASLNC05129，27．39倍。上调的lncRNAs略少于下调的lncRNAs。在检测的rnRNA表达谱中，9例样本平均上调的mRNAs为2604个(从1394到3710)，平均下调的rnRNAs为2344(从1513到2867)，其中在9例样本都上调的mRNAs986个，都下调的mRNAs933个。采用SYBR绿色荧光染料I(SYBRGREENI)实时检测的聚合酶链反应(ImPCR)验证表达上调的6个lncRNAs：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，表达下调的4个lncRNAs：ASLNC00339，ASLNCll435，ASLNCl3387，ASLNCl8814，RT-PCR结果显示ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC0506426个基因表达上调，ASLNC00339，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNCl88144个基因表达下调，和芯片结果基本吻合。GO(GeneOntology)分析显示，在上调表达的mRNAs中，celladhesion、extracellularmatrix和proteinbinding分别在生物学进程(ontology：biologicalprocess)、细胞组件(ontology：cellularcomponent)和分子功日⋯u(ontology：molecularfunction)_三个方面富集程度最高，提示这些上调的mRNAs与这三者相关程度最高；在下调表达的mRNAs中，musclesystemprocess、contractilefiber和structuralconstituentofmuscle分别在生物学进程(ontology：biologicalprocess)、细胞组件1II 中文摘要(ontology：cellularcomponent)和分子功能(ontology：molecularfunction)-一个方面富集程度最高，同样提示这些下调的mRNAs与这三者相关程度最高。Pathways分析显示，在骨肉瘤组织中有32条通路(pathway)受下调的mRNAs调控，富集程度最高的是通路“Hypertrophiccardiomyopathy-Homosapiens(human)”由24个目的基因组成：有34条通路(pathway)受上调的mRNAs调控，富集程度最高的是通路“ECM-receptorinteraction-Homosapiens(human)”由22个目的基因组成。我们选取了6个表达下调的lncRNA：ASLNC00339，ASLNC04683，ASLNC08248，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNC23339和6个表达上调的lncRNA：ASLNC02419，ASLNC21868，ASLNC23844，ASLNC24079，BE050642，BE503655，通过计算与目的基因的Pearson相关系数(≥0．95)，得到227个目的基因并共同建立编码．非编码基因共表达网络(coding-noncodinggeneCO-expressionnetwork)。结论：(1)lncRNAmicroarray基因芯片是筛选骨肉瘤差异表达基因一种理想有效的方法；(2)首次利用IncRNAmicroarray基因芯片揭示在骨肉瘤中存在异常表达的lncRNA基因，利用实时荧光定量PCR对异常表达的部分lncRNA基因进行验证进一步提高了芯片结果的可信度，生物信息学初步分析显示这些lncRNA在骨肉瘤的发生发展中发挥复杂的调控作用；IV 博士学位论文中文摘要(3)IncRNA可能是全新的骨肉瘤肿瘤标记物和潜在的基因治疗靶点关键词：骨肉瘤；IncRNA；微矩阵基因芯片：实时定量荧光PCR；通路分类号： 博士学位论文英文摘要ASLNC02419，ASLNC21868，ASLNC23844，ASLNC24079，BE050642，BE503655andsixunder-regulatedlncRNAs：ASLNC00339，ASLNC04683，ASLNC08248，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNC23339and227targetedcodinggenes．ThelncRNAsandcodinggenesthathadPearsonco．elationcoefficientsequaltoorgreaterthanO．95werechosentoconstructthenetwork．Conclusions：(1)LncRNAmicroarrayanalysiswasidealandeffectivewaytoscreerlthedifferentiallyexpressionprofilesinosteosarcoma；(2)OurresultswerethefirsttorevealdifferentiallyexpressedlncRNAsinosteosarcomaandsomeofthedifferentiallyexpressedlncRNAswerevalidatedbyRT—PCRtopromotethecredibilityofresults．PrelininarybioinformaticanalysisrevealedthatlncRNAwasinvolvedintheoccurrenceanddevelopmentofosteosarcoma；(3)lncRNAsmaybenovelcandidatebiomarkersforthediagnosisofosteosarcomaandpotentialtargetsforgenetherapyKeywords：osteosarcoma；longnoncodingRNAs；microarray；RT．PCR；pathwayClassification：IX 堕主堂垡笙奎一．———————————望!堕!翌FDRFalsediscoveryrate错误发现率PCCPearsoncorrelationcoefficientMAPKEAGlCAMsoRFXistFLCUTRDHFRTFIIBCCNDlDLx5／6SRGlHSRlHSFlNFATTEF．1APNCNEATlKCNQIotlMALATlCBX4XCIPRC2H3K27Oct4HOXBPESP21．PANDAMitogen-activatedproteinkinasesTheetherago-go·1CelladhesionmoleculesOpenreadingframesX．inactivation-specifictranscriptFloweringrepressorlocusUntranslafionregionDihydrofolatereductaseTranscriptionfactorlibCyclinD1Distal．1esshomeobox5／6SER3regulatorygene1HeatshockRNA—lHeatshockfactor1NuclearfactorofactivatedTcellsTranslationelongationfactor1APreinucleolarcompartmentNuclearenrichedadundanttranscript1KCNQloverlappingtranscript1Metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscript1ChromoboxHomolog4XchromosomeinactivationPolycombrepressivecomplex2HistoneH3lysine27Octamer-bindingtranscriptionfactor4HomeoticgenesTheblepharophimosissyndromeP21associatedncRNADNAdamageactivated皮尔逊相关系数促分裂素原活化蛋白激酶电压依耐性钾离子通道-1细胞黏附分子开放阅读编码框X染色体失活特异转录物开花抑制基因非翻译区二氢叶酸还原酶转录因子lib细胞周期蛋白D1远端缺失基因5／6SER3调节基因1热休克RNA．1热休克因子．1细胞核T细胞激活因子l转录延伸因子1A核仁室细胞核增强转录本1KCNQl重叠转录本l肺腺癌转移相关转录因子1染色盒同源物4x染色体失活Polycomb抑制复合体2组蛋白H3赖氨酸27八聚合体结合转录因子4同源基因睑裂综合征P21．DNA损伤激活相关非编码RNA 望主堂垡笙苎——————————————————里!旦控制和某些疾病的发生，包括癌症【15】。非编码蛋白RNA按照它们的分子序列和结构可分为很多种，包括transferR_NAs，ribosomalRNAs，smallnuclearRNAs，microRNAs和其他shortRNAs。在这些当中，长度小于200个核苷酸单位的microRNA是目前被研究的最多的一种非编码蛋白RNA，它参与很多细胞途径，比如细胞增殖、分化和凋亡，还可能和癌症的发生有关。近几年来，长链非编码RNA(10ngnoncodingRNA，IncRNA)逐渐被人们所重视。IncRNA是一种长度大于200个核苷酸单位，缺乏编码蛋白的开放阅读框且不同于任何一类己知的非编码RNA的非编码RNA转录本[161。研究表明lncRNA和一些编码蛋白的基因有某些类似的地方，比如都是由RNA聚合酶II转录复合物转录生成的、大部分序列5’端有楣状结构及由内含子和外显子序列组成[16】，不过，IncRNA的起源仍然是个谜。lncRNA按照基本功能大致可分为两类，一类是不依赖基因位点来影响细胞生物进程，这类lncRNA利用tncRNA本身的核苷酸序列来识别，通过形成RNA抑制物或者直接与DNA或者蛋白质结合来起到顺式作用：第二类则通过调节转录、剪接和邻近基因的转录水平来发挥依赖基因位点的作用[14】。另外，我们按照它们的位置和可能的进化可以将它们分为五类：正义、反义、双向、基因间和基因内f16]。LncRNA在基因组中被广泛转录并在基因调节中起重要作用。研究显示lncRNA的表达和一系列的人类疾病相关，比如癌症和神经系统疾病[17，181。IncRNA参与众多的生命调节活动，从转录干扰、基因印迹和染色体重构到转录激活、x染色体失活和核转运等[19．21】。IncRNA还参与到其他的一些细胞分子活动，在线粒体中合成表达的IncRNA和细胞的复制密切相关，提示其可能在细胞增殖中有一定的作用【22】。还有研究显示lncRNA能够调节神经胶质细胞【23】和哺乳动物视网膜细胞的分化[24]，提示其可能与细胞分化也有一定的联系。目前lncRNA最重要的作用可能是与癌症的发生相关[15】，一些初步的研究显示在神经胶质瘤[25】、肝细胞肝癌[26】和胰腺癌[27】中IncRNA的表达水平有明显变化。LncRNA基因芯片技术是目前广泛应用与研究lncRNA表达谱的一种理想有效的方法。这一技术的原理就是提取样本组织的RNA，与芯片的互补探针杂交后洗涤扫描荧光强度，得到原始数据经过处理后得到lncRNA的差异表达谱。目前，有关lncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的研究基本空白， 博士学位论文前言本研究的目的就是通过利用lncRNA基因芯片研究骨肉瘤与对照癌旁组织中lncRNA的异常表达，发现并筛选异常表达的IncRNA，同时应用RT-PCR验证芯片结果，并通过进一步的GO、Pathways分析及构建基因网络图来进行生物信息学的初步功能分析，探讨IncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的的作用，同时为后续深入研究提供实验基础及研究方向。 望主兰垡堡苎————————————二墅二兰第一章骨肉癌组织与癌旁组织差异表达IneRNA基因的筛选1材料与方法1．1研究对象选取2009年6月．2011年7月在中南大学湘雅二医院骨科行手术治疗精细切除的9例骨肉瘤患者的典型肿瘤标本及正常癌旁组织，肿瘤标本病理诊断均证实为骨肉瘤。临床和病理信息均来自患者的病历和病理报告。手术所取标本立即分管装入冻存管速冻，离体至速冻之间均小于30分钟。其中男7例，女2例，年龄11．48岁，平均年龄21．6岁。肿瘤组织学分型参照Dahlin标准，骨母细胞型3例，软骨母细胞型2例，纤维母细胞型3例，混合型l例；Enneking外科分期：IA期2例，IB期2例，IIA期1例，IIB期1例，III期3例；具体编号见表1．1：CalH1011186N2H10lll86Ca2H1011186N3H1011186Ca3H10lll86A1N1AlClN2C23N13C34N24C26N26C4T011N4TollC9423456789m¨他BM巧怕"他 博士学位论文第一章1．2主要试剂和仪器l-2．1主要试剂及耗材TRIZOLDEPCO．1-10pl吸头10～1001al吸头100～1000pl吸头0．2mlPCR薄壁管1．5ml离心管1．5ml冻存管15ml离心管50ml离心管各种规格一次性吸管无RNA酶的水75％乙醇lmMEDTA0．02M乙酸钠0．2MMOPS，pH7．0甲醛上样染液琼脂糖粉溴化乙锭(EB)染料1．2．2主要仪器设备BCM一1000超净工作台DH一1I旋转混合器涡旋混合仪PH检测仪(ExcelXLl5pH)NanoDropND-1000紫外分光光度计美国Invitrogen公司美国Axygen公司美国Falcon公司(DEPC处理)以无RNA酶水配制华美生物工程公司美国Ambion公司美国Sigma公司华美生物工程公司苏州安泰空气技术公司宁波新芝公司美国Fisher公司美[亘NanoDrop公司 博士学位论文第一章YC．2型层析实验冷柜北京博医康实验仪器有限公司制冰机美国MVE公司双重纯水蒸馏仪美国Millipore公司低温微量离心机德国Eppendorf公司台式离心机德国Eppendorf公司各式电泳仪美国Bio—Rad公司一80℃超低温冰箱日本三洋公司．20。C超低温冰箱日本三洋公司电子天平梅特勒托利多仪器上海公司移液枪(100／200／1000I_t1)德国Eppendorf公司FMl00制冰机美国GRANT公司通风柜哈尔滨东联电子技术公司HumanlncRNAMicroarray(v2．0)芯片美国Arraystar公司AxonGenePix4000B生物芯片扫描仪美国MolecularDevices公司1．2．3其他常用试剂异丙醇、无水乙醇、氯仿、甲醛等均为国产分析纯试剂，由中南大学湘雅二医院中心实验室提供。2实验方法2．1组织总RNA提取2．1．1组织匀浆取约50mg组织样品放入高温灭菌处理后的研钵内，加入lml的Tfizol溶液，充分研磨组织用移液枪移入1．5ml的离心管内，颠倒混匀lO下，室温静置10分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；2．1．2分离阶段4℃，12000rpm离心5—10分钟，取上清。离心得到的沉淀包含细胞外膜、多糖、高分子DNA，上清液中含有RNA。取澄清的匀浆溶液加入0．2ml的氯仿，6 博士学位论文第一童盖好管盖，剧烈震荡15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。再次4。C，12000rpm离心10分钟，样品会分成三层，RNA主要在上层水相中，将上层水相转移到新管的新管内(约5009L)，注意不要吸到中间层和下层液体，否则会造成DNA和蛋白污染；2．1．3RNA沉淀在新管内加入O．5ml预先冷冻的异丙醇，混匀后放置于．20℃中30分钟，后4'C，12000rpm离心10分钟，弃上清。离心前RNA沉淀经常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；2．1．4RNA洗涤小心倒掉上清，留取沉淀。加入lml的75％乙醇(用DEPC水配制)，涡旋振荡混匀样品洗涤沉淀RNA，如不能涡旋混匀，可用手动剧烈颠倒混匀2分钟。然后4"C，7000rpm离心5分钟；2．1．5RNA再溶解离心后小心弃上清，可用移液器小心吸取上清，注意不要吸到沉淀。室温晾置10分钟左右干燥RNA沉淀，注意不要让RNA沉淀完全干燥以免降低RNA的溶解性。最后用适量的DEPC水溶解沉淀，待完全溶解后分成小份一70。C保存或者立即进行逆转录。2．2RNA质量检测2．2．1组织总RNA纯度和浓度的测定使用NanoDropND．1000型紫外分光光度计测定组织总RNA的浓度和纯度，首先需要使用DEPC水进行背景调零后进行测定，操作步骤如下：(1)滴加19LDEPC水(调零)或者RNA样品至测量基座的表面；(2)液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将会在电脑自动生成参数文件；(3)测定完一个后，擦拭干净上下基座表面的样本液体后再进行下一个样本的测定；(4)测定结果：浓度计算：A260下读值为1表示401xgRNA／m1。样品RNA浓度(gg／m1)计算公 博士学位论文第一章式为：A260x稀释倍数×40pg／ml，具体计算举例如下：RNA溶于401aLDEPC水中，取5p．L，1：100稀释至495pL的DEPC水中，测得A260=0．21，RNA浓度=0．21×lOOx4099／ml=840／ag／mI取5此用来测量后，剩余样品RNA为359L，剩余RNA总量为：359Lx84099／ml=29．4lag；(1m121000pL)纯度检测：RNA溶液的A260／A280的比值是一种RNA纯度检测的常用方法，理想的纯的RNA其OD260／A280的比值是1．8-2．1，纯度越高越接近2．0．OD260／A280的比值>2．1或者<1．8都认为是RNA污染。2．2．2组织总RNA完整性测定采用变性琼脂糖凝胶电泳法，方法如下：(1)制胶：lg琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60。C，10ml的10xMOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12．3M)10×MOPS电泳缓冲液配制方法：浓度成分0．4MMOPS，pH7．0O．1M乙酸钠O．01MEDTA灌制凝胶板，预留加样空至少可以加入25止溶液，交凝后取下梳子，将凝胶放入电泳槽内，加足量的IOxMOPS电泳缓冲液至覆盖胶板面几个毫米；(2)准备RNA样品：取399RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为lO肛g／ml。加热至70。C孵育15分钟使样品变性；(3)电泳：上样前凝胶须预电泳5分钟，随后将样品加入上样孔。5-6V／era电压下至溴酚兰指示剂进胶至少2—3cm；(4)紫外透射光下观察并拍照：28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓，上面一条带的密度大概是下面一条带的2倍，还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5s核糖体RNA)组成。在28S和18s核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由 博士学位论文第一章mRNA和其它异型的RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，及更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码相机拍下电泳结果。2．3LncRNA芯片实验我们选择美国Arraystar公司提供的12x135K的HumanLncRNAMicroarray(v2．0)芯片，该芯片数据来源几乎包含了所有权威lneRNA数据库，如NCIBRefseq，UCSCKnownGene6．0，Gencodev13，RNAdb2．0，NRED，LincRNAs，同时也对mRNA序列研究，mRNA数据主要来源于Thecollaborativeconsensuscodingsequence(CCDS)project。2．3．1LncRNA芯片杂交：主要步骤如下：(1)合成双链互补cDNA：使用InvitrogenSuperScriptds·cDNA合成试剂盒，取5}lg总RNA，加入100pmol的oligodTprimers(特制引物)，按照InvitrogenSuperScriptds—cDNA合成试剂盒手册合成；(2)标记纯化双链互补cDNA：ds．cDNA严格按照NimbleGenGeneExpressionAnalysis操作手册纯化和标记，简单来说，先把499的RNaseA加入到ds—cDNA中在37。C中孵育10分钟，然后用苯酚．氯仿．异戊醇混合液清洗接着用冰冻乙醇进行沉淀；标记ds．cDNA按照NimbleGenGeneExpressionAnalysis操作手册使用NimbleGenOne．ColorDNA标记试剂盒，先取l岭的ds—cDNA，加入1OD的Cy3引物在98"C中孵育10分钟，然后加入100pmol的三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶I羧基端大片段(Klennowfragment)并充分混合在37。C中孵育2小时，最后加入0．1体积的0．5MEDTA反应液终止反应，最后用异丙醇／乙醇沉淀进行纯化；(3)标记效率质量检测：用NanoDropND．1000对ds—cDNA进行效率质量检测；(4)芯片杂交：将499标记有Cy3荧光染料的ds-cDNA和Microarrays芯片放进 博士学位论文第一章NimbleGenhybridizationbuffer液中，在杂交培植室内42。C孵育16—20个小时，将杂交后的芯片在ozone-free的环境下按照NimbleGenWashBuffer试剂盒手册进行清洗：2．3．2图像采集和数据分析清洗后的芯片放入AxonGenePix4000B芯片扫描仪，打开GenePixPro6．0软件以5wn／像素的分辨率进行扫描，获得的扫描图像以TIFF格式输入到NimbleScan软件(version2．5)进行网格对齐和数据分析。这些数据需要通过分位数标准化(quantilenormalization)和Robust稳健多芯片平均标准化分析(RobustMultichipAverage，RMA)从而获得标准化的芯片表达数据，再把数据输入到AgilentGeneSpringGX软件(version11．5．1)进行分析，图像定量和标准化数据处理全部完成后以列表形式输出数据，获得的mRNA和lncRNA数据，经过折叠倍率(FoldChange)筛选，筛选出差异表达的rnRNA和lncRNA(FoldChange．2_2．0)重新制作成差异表达的mRNA和lncRNA数据，表达差异巨大的IncRNA和mRNA用和散点图(ScatterPlot)和火山图(VolcanoPlot)标示出来，同时应用AgilentGeneSpringGX软件(versionll．5．1)的聚类分析图表对数据进行聚类分析。3实验结果3．1RNA质量控制3．1．1标本总RNA纯度和浓度紫外吸收测定法检测RNA浓度时，230、260、280nm下的吸光度分别代表了盐、核酸、蛋白质等物质的值。通常只看OD260／280就可以计算实验的总RNA浓度和纯度，RNA在波长260nm处有很高的吸收峰，蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值，利用这个原理测定纯化样品在260hm和280nm处的吸光度，可以推算出样品RNA的浓度，并判断其纯度。纯净的RNA样品A260／A280的比值约为2．O；当三1．8时，溶液中可能有蛋白或者其他有机物的污染；当>2．1时，说明RNA可能有部分降解；在1．8—2．1之间则认为该RNA质量可接受。本实验所提取的RNA利用NanoDropND．1000分光光度计检测，A260／A280值均在1．8．2．1之间，证明提取的RNA质量符合要求，可以进行后续试验。10 RNA提取质量结果见表1-2：表1-2RNA提取质量结果3．1．1标本总RNA完整性从变性琼脂糖凝胶电泳试验的结果图1．1中，我们可以看出电泳分别得到了骨肉瘤组织组合对照癌旁组都有2条清晰明亮的条带：28S和18S，且28S条带的宽度基本接近于18S条带的2倍，这说明本试验得到的总RNA是完整、无降解及DNA污染，可以用于后续试验。 博士学位论文第一章图1-iRNA变性琼脂糖凝胶电泳12345678910ll121314151617183．2lncRNA芯片实验结果：我们选择美国Arraystar公司提供的12×135K的HumanLncRNAMicroarray2．0版)芯片，该芯片收录了目前最全的IncRNA与蛋白编码基12 学位论文第一章(mRNA)，一次杂交实验可以同时检测IncRNA和mRNA的表达水平，殳计了探针为60mer的长寡核苷酸，这些长寡核苷酸探针在高严谨杂交牛下可得到高灵敏度及高特异性的实验结果。本实验以9例骨肉瘤组织枉为一组，9例对照癌旁组织标本为另外一组，使用AxonGenePix4000B牛扫描仪对杂交后的芯片进行扫描得到图像，结果如图1．2，每张芯片信匀匀、清晰，没有边缘化效应、阳性定位和阴性定位对照区域结果明显，凋芯片结果可用。图1-2芯片扫描图正常组肿瘤组．．1通过箱式图(BoxPlot)分析，我们可以观察到芯片扫描后各个组织本后荧光密度值的分布，经过标准化后，所以样本的l092-ratios基本都是同的； 博士学位论文第一章图1．3BoxPlot-lncRNAIlIlIIIIlI●瓣驯牡艟附鼬坩^mc2bI．舢edjnmmgd_g；iHmⅫ．舢№KJI椭113m硼l_s拥Dk图1—4BoxPlot．mRNAif]f1[⋯]1]f][]I]f][]|川]【]I]f]{㈠||l如洲般靴∞^雠堋圳ne11．m11％c|2Jl盯"睇∞』帅瑚re_gram112117jn．H哪T●，l●¨$hntlOlt3．2．2通过散点图(ScatterPolt)分析，我们可以直观分析两组之间芯片表达数据的分布变化，散点图x轴和Y轴是标准化处理后的信号值，绿色的14 博士学位论文第一章线表示折叠倍率线(Foldchange)，本实验我们选定的标准是Foldchange>2．0，这些位于上面绿色线之上的或者位于下面绿色线之下的表示其差异表达倍数之2．0；图1．5ScatterPlot-lncRNAX-Axis。[N]y-Axis[C] 博士学位论文第一章图1-6ScaRerPlot-mRNAx-Axis[N]y-Axis[C]3．2．3通过火山图(VolcanoPolt)分析，我们可以直观分析两组之间芯片表达数据差异的分布变化，散点图x轴和Y轴分别表示P值和变化倍数，绿色分界线表示P值小于0．05和折叠倍率线(Foldchange)≥2．0，红点表示表达有差异的IncRNA；16 垦主兰垡笙奎笙二皇岔三罗go=皇I图1．7VolcanoPlot-lncRNA[1，!。一。[1～口±尹吨尊，0o上砖：f≯曲一小～■!i～≯一：0善。之皆芒蚀jj。_1，‘i且-jr点．耋‘一1。二_一≥呓鞋‘囊‘r一o_i?!舀≠)fE曩～‘1≤．≈蟛’≯j。■l一·一汀：：：．矿1．：i’dJ}1璀瓣铲一4—2O24l092(Foldchange)Selectpair[C]V5IN]、，178765432l 博士学位论文第一章图1-8VolcanoPlot-mRNA口JIL"：rj_--){]八1]I●l飞蓬雾甜廿一8—6—4—202468092(Foldchange)5electpair[C]V5IN]3．2．4经过图像采集和数据分析后我们得到IncRNA和mRNA的数据，设定差异表达的标准：Foldchange>_2．0，P值三0．05．根据此标准筛选得到两组之间差异表达的lncRNA和mRNA。筛选得到的数据显示，骨肉瘤组织组和对照癌旁组织组相比，有1201个lncRNAs表达有差异，其中上调403个(表1．3)，下调798个(表1．4)，其中ASLNC02724(Foldchange：7．2276354)是上调倍数最大的lncRNA，ASLNC05129(Foldchange：27．386826)是下调倍数最大的lncRNA；同时检测到有1919个mRNAs表达有差异，其中上调986个(表1—5)，下调933个(表1-6)，其中NM012445(Foldchange：33．17094)是上调倍数最大的mRNA，NM005963(Foldchange：170．3203)是下调倍数最大的mRNA；1898765432l一叫丁一呵>cI—o-[口。一． 博士学位论文第一章表1．3骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比表达上调的lncRNAs(前50个)19 博士学位论文第一章表1．4骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比表达下调的lncRNAs(前50个)SEQ_IDFDRp-valueFoldchangeregulationASLNC05l290．0206708570．000l1380427．386826ASLNC046830．0220225210．00013434122．388136ASLNC217920．0400731040．00056957413．600891ASLNC202710．006704661．34968E·0513．130057ASLNCll4350．034543970．00039287111．647422ASLNC005600．0310650320．00031730910．517859ASLNCl82610．0289920720．0002776659．553265ASLNC224400．0206708570．000l160088．431529ASU、lCl09180．0130874514．86169E·057．4500036ASLNC243lO0．0198201160．0001076067．0071945ASLNC082480．037991260．0005003126．6065974ASLNCl29570．031418840．0003354056．3973017ASLNC038160．0681318640．0015380685．8261676DN9962110．03799126O．0005013535．8198376ASLNC21283O．0179495879．34207E-055．673939AK2998150．069490120．0016221235．4372163ASLNC037000．070480620．0017294645．398673AM392923O．Ol36652275．61305E-055．239583ASLNC079560．0408447760．0006077345．0942802ASLNC233390．0084914781．91658E-055．074055ASLNC036650．0312171820．0003246914．931716ASLNCl22280．104243350．003809674．916068ASLNC250600．102058860．0036482944．823394AK094780O．0178104459．00878E-054．6728005ASLNC175680．0206708570．000154964．517209ASLNCl11730．02194310．0001258254．4823823ASLNC068980．023770740．0001595064．454507421down AA4238490．0165333738．0685E-054．3674726downASLNCl73210．027497430．0002356534．1424265ASLNC217550．090445580．0028414254．099812ASLNCl4927O．0306270890．0003064024．0955243ASLNC224940．04809240．0008406893．91878EC5000700．087925920．002692543．8556428ASLNCl85760．0489383450．0008926113．8124135ASLNCl8635O．07091131O．0017475863．7816076BM9316280．0608465820．0012768393．737187AW013995O．0129004874．0911IE-053．7226892ASLNC03766O．04115753O．0006377123．6888585ASLNCl3387O．027497430．0002375643．6517124ASLNC033420．048196547O．000852623．6249814ASLNC224250．0393950．000547923．6015074DAl053370．103192880．0037144043．5567293ASLNCl20570．089693540．0027842563．5018144ASLNCl70520．103437070．003760663．4472015ASLNCl60320．107231150．0040752153．440188ASLNC236560．120866090．0051463753．438067ASLNC239860．06543953O．0014330993．4350092AV648161O．0408447760．0006078133．397511ASLNCl7695O．08148234O．0022737993．3865955ASLNCl8906O．1063934040．0039812473．376416down 博士学位论文第一章NM0132270．0012313191．54367E．0533．17094NM0010400580．0004972912．85869E一0629．911383NM004994NM130830NM001844NM0028254．29141E．055．24879E一0926．7770160．0005079853．04443E．0618．3350370．0118605930．00094510517．7293220．0004528052．48081E．0616．175854NM0011350570．0002576252．73112E-0715．695157NM002997NM0004220．0023783696．35508E．0514．9020560．0393543880．00584347212．875093NM0010988000．000271565．79778E一0712．624476NM0011110340．0008707928．41396E-0612．421213NM021102NM000089NM000478NM000316NM006332NM177537NM138455NM0528540．0078031；440．0001683230．00048294910．82053854．50333E．0810．5803510．0009389351．04296E．059．2325060．0081182650．0005198039．162490．0002576253．72595E．078．9733720．0003776621．63452E-068．8272960．000271565．97858E-078．4499750．0002576253．98598E．078．212279NM0010252950．0022473665．56239E-057．727952NM0010053770．0009389351．03448E-057．3920665NM080680NM030801NM002458NM001135NM0219390．0027674998．58996E．057．2194770．0022874275．90322E一057．19776730．017832510．0017298247．15585769340．002399856．47412E一057．00441360．0019469674．09478E-056．9318733NM0011110350．0080812250．0005144666．9186525up 堡主兰垡堡茎一．兰二兰NM033316NM012391NM015507NM052959NM000424NM032704NM013230NM000088NM021978NM006142NM002274NM005202NM153360NMo00526NM152860NM0001650．0023783696．35946E一056．80251t70．030438150．0038810886．7837930．0015114832．41253E一056．76399660．0071654310．0004303646．67234750．1503462O．0443499056．65478320．0013297111．80526E-056．6418910．0047671360．0002203986．56852lO．0010082330．0019821931．17767E．056．5485134．47734E．056．4l090540．0840015560．0182828746．3891750．110328420．0277440366．3528510．∞52304950．0002587746．317080．0018423093．47143E-056．1715680。1261690．0340267426．15577750．0068747920．0004040296．0383340．0031969270．0001095585．9871845NM0010424230．0002166379．27386E一085．9639935NM001898NM002659O．0189806130．0003607190．0019082765．85989861．3677E．065．7460465NM001136528O．014934907O．0013499145．5796995NM0029750．0025827387．49453E-055．5102696NM0011137550．0042171730．0001767895．4699464NM0045600．0002576253．73434E·075．4627934up24 博士学位论文第一章表1．6骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比表达下调的mRNAs(前50个)SEQ_IDFDRp-valueFoldchangeregulationNM一0059630．0014322552．11089E一05170．3203NM206821NM133378NM206819NM013292NM002465NM002469NM005368NM017533NM203377NM000432NM206820NM004543NM079420NM003063NM173201NM001100NM207163NM014476NM021245NM000257NM004533NM003280NM144994NM079422NM0056090．0019226080．000037742166．343340．0009389351．04505E·05166．279680．001245780．0014615631．57607E．05159．052722．22702E-05151．944960．0022874275．84051E-05131．99043O．0037583350．000147097129．649750．000946411．06202E一05121．693460．0008926240．0026585569．18071E．06113．404847．91085E一05113．207630．0017740383．17562E-05105．700290．0041901050．000175015100．7698750．0017740383．18891E．0595．126090．0023423030．0007330996．15943E．0590．698126．3662E_0685．680420．0020702254．86159E-0577．322876O．0019469674．17785E一0574．1019740．0022570640．0031395530．0016282640．0021078445．67303E．0570．0177460．00010640769．953442．72838E．0569．392755．01438E．0564．7l10060．0005820434．05535E一0659．960740．004155610．00017230358．942511．06744E-0557．4365960．0017718453．12067E-0557．1565670．0019300333．85753E一0555．980976downNM0175340．0049823490．00023418752．414913down25 博士学位论文第一章3．2．4聚类分析：根据不同样品间IncRNA和mRNA表达水平的不同，我们可以通过分层聚类分析，表达程度越相似的样品更容易聚类在一起，由此我们可以进一步分析不同样品之间的关系：图中红色代表相对高表达，蓝色代表相对低表达： 博士学位论文第一章图I-9骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比差异表达的IncRNA的聚类分析kEi目Ej__一iEiiiiii一一一22222；5i一}2一=!!===5一—2====2}22⋯==一E—#三三暮亘鱼亘亘勇一一——?亘亘重量雪亘弓重量苎!!!里里要看雾—亏再目目iL————=：：————————，二——ii一芦量星量星星暑詈睁竖量查鱼—曼曼萼室孽自--量}≤三■——星要画号一r自目目目目目目虱ii目目jiiii——————————=======：—————————一●-_-——一————————————————_一．_________■■■■■——_-．-o一—--．Iii===一一—一—一一，r———_一====7一=～一—■■■一——====!，熏塞雪雾震竺苎一’—‘’鲁!}ii一__-蓄i一——=I二=一一三三=j三三r===至．．：一兰兰三兰三!三==j；；ii．。广-!iii=!三i』兰一一目_1％ii≠2||ij|iiiiiiiiiiiiii=j=i=i!!!|i；；；ii—————；ii一一iiiiii；；；；iiiiiiiii一—!，‘雩!!!呈，一⋯————j{=—一，s鼍一。．．一工I工I工lCq-_C-J巾岬帕UZ∞∞∞o工I工I工IZ27groupsample—z、N己一z、N寻一一z．．1z一4一暑，兰亏上】字、NN9一一z、兰n一一u．N￥一口f9∞_【．【苫可、∞81_【10一u、∞∞=_【口一u．Nu一口、．【u_【三一u，。u亏上]一u、S口一可．nu￡] 博士学位论文第一章图1-10骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比表达差异的mRNA的聚类分析4讨论；；；；；；=====；—-=；i；；iii----—一·-一———————J■●●!=一●一_-l’——。‘。●__L一—————————————一—————————===—一三三彳—三三三三===三三—_二二二一——===L———!!!L——．!!!，。。——————————一——————————===j_一——=—一：=f—_===!宝—-——————一——一——!l—-!!!!!!=号兰===_—。==———。2一——暑富P—三三==尸—卜j一～一!==———一一I_____r————————————————一一!!!，==!===●——===-——====一—!}=5鼍兰=，==彳——告葺三=-；=——__·——一·_·—————————一一===；，—E!!!，i士==一；一～——————————_==一一___l_-—。E=_———：=!!。一—!—=；一————一——一groupsample骨肉瘤是一种比较常见的恶性肿瘤，在青少年中的年发病率约为3／100万人[1】，该肿瘤常常累及到年轻患者长骨的干骺端，如股骨、肱骨远端。骨肉瘤的主要致死因素为肺部转移，近十年来，虽然骨肉瘤的生存率已经提高到60％左右[28]，但是耐药仍然是骨肉瘤临床治疗中的主要问题。目前，骨肉瘤的发病机制昙，∞∞=_【。．IH．￡N一一z，∞∞：苫_【H-N邑暑．∞∞=苫_【H__【己拿、N己暑、N寻一一z，．【z一匹一冒．兰亏上]冒，NN9一暑、兰n一可、口∞．【：。_【H-￡eu—u，∞墨．【_【o_【H-Ne)一[)．口旦=。．【H．1e已口．∞些。上]口，N￥一一u，N岂一u，古∞一一u．6；一【)．nu￡] 博士学位论文第一章仍不清楚，有学者认为是病毒感染可以引起骨肉瘤的发生[29】；放射线也是引起骨肉瘤的～个潜在因素[29】；一些骨肉瘤家族聚集发病提示我们基因遗传倾向性也是发病的一个重要方面，最有利的证据就是患视网膜神经胶质细胞瘤的病人骨肉瘤的发病率比正常人高500倍[301；最有意思的是有研究对大样本的儿童骨肉瘤患者进行检查，发现有3％．4％的病人存在P53基因变异，而大部分P53基因变异的病人患有家族性李弗劳明综合征(Li-Fraumenisyndrome)[31]，这说明骨肉瘤的发生可能与基因变异密切相关。随着各种化疗方案的临床应用及相关基础实验研究的不断深入，发现许多因素均可影响骨肉瘤的化疗疗效和耐药形成，如药物选择、给药途径、剂量强度、肿瘤细胞的恶性程度等[32，331。进一步深入研究骨肉瘤的发病机制及基因变异在骨肉瘤发病、诊断和治疗上可能发挥的作用，对防治骨肉瘤具有非常重要的意义。为了提高骨肉瘤的治疗效果，需要找到新的治疗靶点，研究发展新的有效的综合治疗手段。自从斯坦福大学的M．Schena[34]等发表第一篇基因芯片研究的文章以来，人们开始大量的应用基因芯片研究基因功能，包括各种疾病的发病机制、诊断及基因治疗方面的应用，尤其在肿瘤发生、诊断及治疗的基因分子生物学研究。基因芯片相对于传统的研究基因的技术手段，有以下几个明显的优势：(1)高通量，基因芯片最多一次可包含数万个eDNA或者寡核苷酸片段，通过一次实验就能观察到所有这些基因或者基因片段的表达变化，如本研究采用的HumanLncRNAMicroarray(v2．0)芯片一次实验就能检测到超过2万个lncRNA基因的表达变化；(2)快速，和传统的基因表达研究方式相比，基因芯片实验能大大缩短研究时间，短时间内就可以完成对成千上万个基因的表达分析；(3)自动化统计和数据分析，目前基因芯片的制作、数据采集和结果分析基本都是由相关的自动化设备和分析仪器完成，方便用于进一步的生物信息学研究。LncRNA是一类长度超过200个核苷酸单位，和mRNA转录本结构类似但是没有编码蛋白功能的基因片段[35]，很多的IncRNA被甲基化修饰并保留在核内，但是也有部分被转运到胞浆[36】。目前为止，只有小部分的IncRNA有了初步的功能特征描述，但是功能范围却很广泛，包括了参与表观修饰调节和剪接[35—37】，这提示我们可能有很多有潜在功能的基因被我29 博士学位论文第一章们忽视了。LncRNA的异常表达已经在很多肿瘤研究中报道，Pan[38]和Yang[26]分别研究报道了lneRNA在肝细胞肝癌中的异常表达，Yang通过研究还发现一个特殊的lncRNA基因．IncRNA—HEIH，它不仅参与Go／Gl细胞周期阻滞，还与蝇zeste基因增强子的人类同源基因(enhancerofzestehomolog2,EZH2)功能状态密切相关。Gibb报道了IncRNA在宫颈上皮内瘤样病变的异常表达，揭示了在瘤形成的早期阶段同样也存在IncRNA基因的异常表达[39】，异常表达的IncRNA基因还分别在口腔鳞癌【40]、胰腺癌[27]、肾癌[41】、膀胱癌[42】、肺癌[43，44]、前列腺癌【45】、乳腺癌[461等中报道。目前国内外尚无IncRNA在骨肉瘤中差异表达的报道研究。为了研究骨肉瘤IncRNA基因表达谱，我们采用上海康成生物科技公司提供的美国Arraystar基因芯片．HumanLncRNAMicroarray(v2．O)对9例骨肉瘤组织及正常对照癌旁组织进行基因表达谱分析，比较骨肉瘤与正常癌旁基因表达谱，筛选异常表达IncRNA基因，这在国内外尚属首次。结果筛选出9例样本平均上调的lncRNAs为3528个(从2723到4537)，平均下调的lncRNAs为3958(从3469到4368)，1201个IncRNAs基因在9例样本中表达均有差异，其中上调403个，下调798个，其中ASLNC02724(Foldchange：7．2276354)是上调倍数最大的IncRNA，ASLNC05129(Foldchange：27．386826)是下调倍数最大的IncRNA，上调的lncRNAs略少于下调的lncRNAs；同时检测到9例样本平均上调的mRNAs为2604个(从1394到3710)，平均下调的mRNAs为2344(从1513到2867)，1919个mRNAs基因在9例样本中表达均有差异，其中上调986个，下调933个，其中NM012445(Foldchange：33．17094)是上调倍数最大的mRNA，NM005963(Foldchange：170．3203)是下调倍数最大的mRNA，上调的mRNAs基本等于下调的mRNAs。实验结果发现，数量众多的IncRNA在骨肉瘤中表达有差异，有些明显上调，如ASLNC02724(Foldchange：7．2276354)；有些明显下调，如ASLNC05129(Foldchange：27．386826)，提示这些表达有变化的IncRNA参与了骨肉瘤的分子调节过程。在这些筛选的差异表达lncRNA中，下调表达的lncRNAASLNCl8814与癌基因MDM2(murinedoubleminute2)是反义互补链，MDM2位于染色体12q13．14上，与众多肿瘤的发生关系密切[47]。有研究显示，MDM2能过选择性的激活P53途径促进骨肉瘤细胞 博士学位论文第一章的增殖和抑制其凋亡【48]，但是ASLNCl8814基因和MDM2具体通过什么样的机制来参与骨肉瘤发生和进展还需要更进一步的研究。另外一个值得注意的是上调表达的IncRNABC050642，研究发现BC050642与C—MYC启动子结合蛋白一l密切相关，而C—MYC蛋白的表达是骨肉瘤患者预后的重要因素之一，可以用来评估骨肉瘤患者病情进展和预后[49】。综上所述，我们通过芯片实验筛选出骨肉瘤差异表达的基因，发现部分lneRNA和骨肉瘤有紧密联系，研究结果有助于人们从分子基因水平理解骨肉瘤发生的病因，探讨它们在骨肉瘤疾病进展及转归方面的作用，为寻找理想的骨肉瘤肿瘤标志物及早期诊断甚至是基因治疗手段提供可靠的线索，为后续研究提供实验基础和研究方向。5小结(1)Microarray基因芯片是筛选差异表达lncRNA和mRNA的一种理想有效的方法；(2)第一次利用Microarray基因芯片研究骨肉瘤的lncRNA基因表达谱，经Microarray基因芯片检测，骨肉瘤组织组和对照癌旁组织组相比，有1201个lncRNAs表达有差异，其中上调表达403个，下调表达798个；同时检测到有1919个mRNAs表达有差异，其中上调表达986个，下调表达933个。 博士学位论文第二章第二章骨肉瘤组织与癌旁组织差异表达IncRNA的实时荧光定量PCR验证从前面的实验中我们得到了骨肉瘤组织和正常癌旁组织的IncRNA的差异表达谱，我们为便于后续研究选取了相对位置关系属于反义(antisense)，变化倍数大的8个lncRNAs：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655(上调)；ASLNC00339，ASLNCl1435，ASLNC13387(下调)和2个有文献报道相关基因的lncRNAs：BC050642(上调)和ASLNCl8814(下调)来做进一步分析。本研究采用SYGBGreenI实时荧光定量PCR来验证这10个基因在骨肉瘤组织和正常癌旁组织中的表达是否和芯片实验结果一致；1材料与方法1．1材料样品来自第一部分实验所抽提的剩余总RNA，各组RNA己保存于．80。C冰箱里，故可以直接使用；1．2主要仪器和试剂1．2．1主要试剂及耗材O．1-10I．d吸头lO-lOOpl吸头10旷l000ul吸头0．2mlPCR薄壁管1．5ml离心管1．5ml冻存管RNase水PrimeScriptRTreagentkit逆转录试剂盒(DRR047S)SYBRIPremixExTapTMIIRT-PCR试剂盒(DRR820A)美国Axygen公司日本TaKaRa公司日本瑚<出a公司 博士学位论文第二章1．2．2主要仪器设备BCM．1000超净工作台荧光定量PCR仪Rotor-Gene3000ADH．II旋转混合器涡旋混合仪YC02型层析实验冷柜制冰机双重纯水蒸馏仪低温微量离心机台式离心机一80℃超低温冰箱．20℃超低温冰箱移液枪(100／200／100091)FMl00制冰机通风柜PCR热循环仪1．2．3其他常用试剂苏州安泰空气技术公司美国Corbett公司宁波新芝公司美国Fisherscientific公司北京博医康实验仪器有限公司美国MVE公司美国Millipore公司德国Eppendorf公德国Eppendorf公司日本三洋公司德国Eppendorf公司美国GRANT公司哈尔滨东联电子技术公司美国Fisher公司异丙醇、无水乙醇、氯仿等均为国产分析纯试剂及蒸馏水，由中南大学湘雅二医院中心实验室提供。2实验方法2．1RNA逆转录成eDNARNA逆转录成eDNA采用TaKaRa公司的逆转录试剂盒(PrimeScriptRTreagentkitwithgDNAEraser：DRR047s)，该试剂盒增加了去除基因组DNA的gDNAEraser，实验具体操作步骤如下：(1)提取lgg的RNA，混合加入5XgDNAEraserBuffer29L、gDNAEraser11．tL再加入RNaseflee水至体积lOgL，放在普通PCR热循环仪42。C孵育2分钟(或者室温下5．30分钟)而后降温至4℃；(2)按照以下成分(表2一1)冰上操作配制反应液体系： 博士学位论文第二章5xPrimeScriptBuffer2PfimeScriptRTEnzymeMix1RTPrimetMix*4(1)的反应液RNasefree水4LLL1儿1LLL10uLUpt020此反转录的温度设定为：37。C15分钟85℃5秒钟4℃收集反应产物，冰上冷却，若eDNA当天不使用，则要保存在．20。C；2．2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR采用TaKaRa公司的RealTime试剂盒(SYBRIPremixExTapTrail，DRR820A)扩增lO个lncRNAs基因：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASLNCll435，ASLNCl3387，ASLNCl8814(表2．2)。反应体系、反应条件及具体操作步骤根据试剂盒说明书及退火温度设定，由于RNA纯化及RNA反转录为cDNA的效率均有可能不同等其他客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能不同，因此我们选用GAPDH来作为内参照进行标准化处理，最终得到的比值为样品待测基因的相对值；表2-2实时荧光定量PCR检测始lo个lncRNAs 博士学位论文第二章通过NCBI途径，从GeneBank中查找相关lncRNA基因全长序列，利用primer5软件进行引物设计，引物由上海铂尚生物公司合成，各IncRNA基因序列及GAPDH引物序列见表2—3，拆开包装后，按照说明手册将每对引物根据分子量稀释成100}tM，并置于-20"C保存；表2-3RealTime引物序列基因名称序列ASLNC00339上游弓l，囱CTTGTcTGTCTGT八AGGTTAATGGASLNC00339下游引物AGAGCGGAAGGAAGAAGAGGASLNCI1435上游引物GTCCTTCCATCGTCAGCACAGASLNCll435ASLNCl3387ASLNCl8814下游引物上游引物下游引物上游引物下游引物AC_盯TCTCCTCACAACCACATCCGGAGTGGTGGTAGlvrGTGGAAGCGATATGCTGTGGTGCTTAATGCAGTTGCTllACAGAATGCrnAGTCCGCTCCGTGTTTGGTCAGTGGASLNC21868上游引物TTCn℃CTCTCTTCTATGGTT℃CASLNC21868下游引物TGCCCTTTGCCCTCCTCASLNC22124上游引物ATAGCAGCAGCAGCAGCAGASLNC22124下游引物GGAGAAGGCGGAAGAGAAGGASLNC23844上游引物GCACCACAAACATTCAGGAACCASLNC23844ASLNC24587BE503655BC050642H．GAPDH下游引物上游引物下游引物上游引物下游引物上游引物下游引物上游引物GCAGGATAGCCAAGCACACTCACAGGGTAGGCAGAACATTTAGAGAAGGlIATGTGGCA丁兀ATTTGGGAACTCCACTGCCCACTTACGGAGAC。ITTCCTGAAGACCCTGAGGTGGTGCTTCAACTGGl’ATCl’ATGGTTTGTCAATCTTCTCTTGTTCTGTGGGAGTCCACTGGCGTCTTCH．GAPDH下游引物GGCATTGCTGATGATCTTGAGG35 博士学位论文第二章设定在每个循环的变性期结束后，程序自动记录上一个循环最后10％时间的平均荧光值，以表示上一个循环结束时的PCR产物的量。反应完成后，得到所有标本的所有记录曲线，软件将自动进行数据分析，调整基线，计算出阈值(Threshold)，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数称为CT值。每一次反应均以无酶水代替模板为阴性对照，实验重复三次以上。首先分别计算所有标本中各个lncRNA基因和内参GAPDH的3个重复孔的平均CT值。数据处理采用文献报道[50]的Delta-deltaCT法来测定目的基因的相对表达量，该方法直接利用管家基因来校正样品初始量，我们根据所扩增的目的基因和管家基因的CT值经过公式计算，即可计算出所扩增的目的基因相对于管 博士学位论文第二章家基因的变化倍数，公式如下：l厂对照组目的基对照组看囊基]广待检样品目的待检样品看安7F=2一LL因平均cI值因平均cl值JL基因平均cI值基因平均cI值川3实验结果3．1根据检测结果，组织总RNA的OD值A260nm／A280nm比值都是在1．8．2．0之间，且实时荧光定量PCR实验结果显示，各熔解曲线均只有一个峰值，证明所有扩增产物均为特异性的，无非特异性产物存在；图2—1至图2—1l采用实时荧光定量PCR检测ASLNC21868，ASLNC22124．ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNCl8814的熔解曲线及扩增曲线；图2．1GAPDH 博士学位论文第二章图2．2ASLNC21868图2．3ASLNC22124 博士学位论文第二章图2-4ASLNC23844图2—5ASLNC2458739 图2-6BE503655图2—7BC050642 博士学位论文第二章图2．8ASLNC00339图2—9ASLNCl1435 堕主兰垡堡苎第二章图2．10ASLNCl3387图2—10ASLNCl881475∞859095deaS101520嚣3口嚣柏45C咄3．2实时荧光定量PCR检测骨肉瘤组织及正常癌旁组织中IncRNA基因：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNCl8814的表达，如表2-6，图2一12，2．13所示，与正常癌旁组织对比，骨肉瘤组织中的IncRNA基因：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642表达下调(P三O．05)；而lncRNA基因ASLNC00339，ASLNCll435，42 博士学位论文第二章ASLNCl3387，ASLNCl8814的表达则上调(P耋0．05)，实时荧光定量PCR检测结果与芯片结果是一致的；表2-6骨肉瘤组织与正常癌旁组织中各lncRNAs基因的表达结果(2一AACT)A：图2-12Microarray芯片和实时荧光定量PCR结果比较图■qPCR口genechip图2．13骨肉瘤组织和正常癌旁组织IncRNA基因RT-PCR的DeltaCT值比较438642o之4缶名∞控¨一；lJN西oI．a∞毛u3p1011 博士学位论文第二章疆0．2宝霉芍《0．1OT占工TI工|工4讨论本课题第一部分选取了9例骨肉瘤组织标本和癌旁正常组织标本进行了HumanLneRNAMieroarray芯片检测，得到了差异表达的lncRNA基因表达谱，包含了1201个lncRNAs表达差异基因，其中上调403个，下调798个。为了避免芯片筛选出现假阳性，提高芯片结果的可信度，本部分实验我们按照位置关系属于反义(antisense)、差异表达倍数较大或者有文献报道相关基因的标准选择其中10个：ASU町C21868，ASU寸C22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASUNCll435，ASLNCl3387，ASLNCl8814基因进行SYGBGreenI实时荧光定量PCR实验验证。实时荧光定量PCR(Real—timeQuantitativePCR)最早是在1992年由Blake[51，52]等提出，该方法是对待测样品中目的基因进行准确定量的一种理想手段。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通常情况下是染料或者探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，从而荧光信号的 博士学位论文第二章增强与PCR产物增加完全同步，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程[53】。本实验采用能与双链DNA结合发光的荧光染料SYGBGreenI，扩增过程中随着反应的进行合成的双链DNA增多，荧光强度也就增加，通过测定各反应管的荧光信号与荧光阈值线的交叉点所对应的循环次数(指数扩增的开始阶段，即循环阈值．Ct值)，对模板起始浓度定量。SYGBGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号值检测出PCR体系存在的双链DNA数量，并且通过熔解曲线的分析，排除非特异性扩增的干扰，对靶基因进行相对定量分析，其准确性和灵敏性都非常高，通过计算2-△△cT分析基因表达有无差异[50，54]。这种计算方法不需要绘制标准曲线，因此比绝对定量法更加简便可行，广泛应用于实时荧光定量PCR的数据分析。本部分实验中的的熔解曲线很好的显示了扩增产物的一致性，没有出现非特异性产物，见图2．1到2—11。SYGBGreenl实时荧光定量PCR实验结果显示，ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642基因在骨肉瘤组织中的表达量上调，ASLNC00339，ASLNCll435，ASLNCl3387，ASLNCl8814基因在骨肉瘤组织中的表达量下调，基因表达的差异方向与芯片实验结果一致，进一步确认这些基因在骨肉瘤中差异表达，同时也说明芯片实验结果可信。5小结利用实时荧光定量PCR对在骨肉瘤组织中的异常表达的lncRNA基因：ASLNC21868，ASU町C22124，ASLNC23844，ASUNC24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASLNCll435，ASLNCl3387，ASLNCl8814进行检测，实时荧光定量PCR结果与芯片结果一致，进一步提高了芯片结果的可靠性；45 博士学位论文第三章第三章骨肉瘤组织与癌旁组织差异表达lncRNA基因的初步生物信息学研究前面的芯片实验我们在骨肉瘤组织和正常癌旁组织中表达差异的IncRNA和mRNA，并对一部分lncRNA基因进行实时荧光定量PCR验证，得到了与芯片表达一致的结果。这一部分我们将对表达差异的基因进行基因本体论(GoneOntology，GO)和KEGG生物学途径分析(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomesPathwayanalysis)，并通过建立lncRNA基因与靶基因的基因网络图来探索这些差异表达的IncRNA基因与骨肉瘤发生的关系；1材料和方法基因本体论(GeneOntology，GO)数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它通过对mRNA数据进行GO分类来分析差异表达的mRNA的功能属性，并把它们的功能分为三类：biologicalprocess生物学进程，cellularcomponent细胞组件，molecularfunction分子功能。研究者可以通过GO分类号和各种GO数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。在芯片的数据分析中，先对差异表达的mRNA靶基因进行功能注释，然后通过计算基因功能的显著性水平(Pvalue)和误判率(FDR)，得到显著性的基因功能，这部分显著性的基因功能就是差异mRNA调控引起的，本实验设定显著性标准：P值三0．05，P值越小，此GO功能途径越显著：KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)是系统分析基因功能以及基因组信息的数据库，它有助于研究者把基因及其表达信息作为一个整体网络进行研究，是进行生物体内代谢分析以及代谢网络研究的强有力工具。KEGG能够将基因组中的一系列基因用一个细胞内的分子相互作用的网络连接起来，如一个通路或者是一个复合物，通过它们来展现更高一级的生物学功能。基于最新的KEGG数据库，对差异表达的mRNA数据进行生物学途径分析(Pathwayanalysis)，从而能够明确差异表达的mRNA数据主要富集分布于哪些生物途径，并计算pathway的显著性水平(Pvalue)和误判率(FDR)，筛选基因参与的显 博士学位论文第三章著性pathway，本实验设定的筛选标准为：P值三0．05，P值越小，此生物学途径越显著：基因网络图是研究生物基因调控的一个重要方面，通过构建目的基因与其他相关基因的网络图谱，能够更加直观的研究基因在整个调控机制中的重要。本研究选取差异表达倍数较大的12个lncRNAs基因：ASLNC02419，ASLNC21868，ASLNC23844，ASLNC24079，BC050642，BE503655，ASLNC00339，ASLNC04683，ASLNC08248，ASLNCll435，ASLNCl3387，ASLNC23339与其目标靶编码蛋白基因按照以下步骤构建一个编码一非编码基因共表达网络图；(1)数据预处理：coding基因部分相同gene的不同transcripts取median值代表gene的表达值；lncRNA表达值部分不用特别处理；(2)从数据库中挑选12个lncKNAs基因的数据，并取出与其目标靶编码蛋白基因子集；(3)利用R系数计算12个lncRNAs基因与目标靶编码蛋白基因的相关系数Pearsoncorrelationcoefficient(PCC)．这个相关性只考虑IncRNA基因与目标靶编码蛋白基因的关系，不计算IncRNA基因与lncRNA基因、编码蛋白基因与编码蛋白基因的关系：(4)对PCC进行筛选，挑选PCC>__O．95的部分作为有相关性关系的Pair：(5)使用cytoscape工具绘图。粉红色node代表coding基因，绿色node代表下调IncRNA，红色node代表上调lncRNA；实线代表连接的两个node问为正相关，虚线表示负相关：2实验结果对本实验第一部分得到的差异表达mRNA数据进行基因本体论(GeneOntology，GO)分析，设定的筛选标准为：P值三o．05，得到这些差异表达mRNA分别在基因本体论三个功能方面的富集表达谱：2．1在biologicalprocess生物学进程方面，上调表达mRNA基因中有780个基因富集于生物学进程(表3—1)，下调表达mRNA基因中有617个基因富集于生物学进程(表3．2)；图3．1显示基因富集数量最多的生物学进程；图3．2显示基因富集程度最高的生物学进程(TheGOID‘sEnrichmentScorevalue，itequals47 (一l0910(Pvalue)))；表3．1上调表达mR．NA基因．生物学进程(前50个)Enrichment．GO．IDTermOntologyPvalueFDRRrnrPGO：0007155celladhesionBiologicalprocess1．15018E-202．10599E-1719．93923291GO：0022610biologicaladhesionBiologicalprocess1．15018E-202．10599E-1719·93923291GO：00400llGO：0006928GO：0042221GO：0002376locomotioncellularcomponentmovementresponsetochemicalstimulusimmunesystemprocessBiologicalprocess2．78516E-183．39975E一1517．55515054Biologicalprocess8．24477E一177．54809E-1416·08382154Biologicalprocess4．12248E·163．01931E-1315·38484125Biologicalprocess5．2355E-163．1954E_1315·28104201GO：0006950responsetostressBiologicalprocess1．29951E-156．79831E-1314·88621923responsetoexternalGO：0009605。．’．SUmUlUSGO：00l6477cellmigrationGO：0006935chemotaxisGO：0042330taxiscellularcomponentGO：0016043．organlzattonBiologicalprocess1．49055E一146．82301E·1213．82665227Biologicalprocess2．90774E-141．18313E-1113．53644424Biologicalprocess6．08101E-142．02443E一1113·21602396Biologicalprocess6．08101E·142．02443E-1113．21602396Biologicalprocess2．15668E一136．58146E·1112·66621457GO：0048731systemdevelopmentBiologicalprocess6．41454E一131．80693E-1012·19283475OO：0048870cellmotilityBiologicalprocess8．69759E-132．12337E-1012-0606012GO：0051674Iocali删ionofcellBiologicalprocess8．69759E-132．12337E-1012·0606012GO：0050896responsetostimulusBiologicalprocess9．7253E一132．22588E_1012·01209708GO：0048856GO：0051716GO：0070887anatomlcaIstrl劬JreBiologicalprocess1．28342E．122．76463E一1011．89163288developmentcellularresponsetoBi0109icalDrocess3．01718E．126．13828E．1011．52039881stimulusc8llul缸。e8ponsetoBiologicalprocess3．73482E．127．19837E一1011．42773079chemicalstimuluscellularcomponentGO：0071840o删zationorBiologicalprocess4．28382E-127·84367E-1011．36816896biogenesisnn：on71842。。11Ⅲal"!：omponemBiologicalprocess1．9586E—113．41543E．．．．．．．-0910·70805365organiz—at—io—na—t———————————————————————————————一 』堂堂堡堕壅．——一．一．一一一一笙三童———‘—‘’’——’●‘。_。。-。。__-_____●__-。。-_--__--_●___l_-_______---_-——————，-_-●—，_————‘-___-————一一’’一●cellul81"levelGO：0006955immuneresponseBiologicalprocess4．28021E．117．1246E．0910．36853499GO：0009888tissuedevelopmentBiologicalprocess5,20518E．118．28756E-0910．28356387GO：0009611respon—setoBiologic引process6．97817E．1l1．03294E．0810．15625819wounding一—‘’。GO：0045087anatomicalstructuremorphogenesisirmateimmuneresponseBiologicalprocess7,05172E-111．03294E-0810．15170474Biologicalprocess8．47535E．111．19372E．0810．07184221GO：0008283cellproliferationBiologicalprocess1,0591E．10】．43645E．089．975064845GO：0006952defenseresponseBiologicalprocess1．26211E．101．65066E．089．898901994GO：0048513organdevelopmentcellularcomponentGO：00718417婶嘲tlono。b109eneslsatcellularlevelBiologicalprocess2．08997E．102．63912E-089．679860765Biologicalprocess2．35427E．102．87377E．089．62814449GO：0042060woundhealingBiologicalprocess3．0147E．103,50715E-089,520755239Go：0007010G0：0065008cytoskeletonorganizationregulationofbiologicalqualityBiologicalprocess3．06468E．103．50715E一089．513614298Biologicalprocess4．03808E．104．48105E．089．393825022GO．0050900leukocytemigrationBiologicalprocess7．6582E-108．15352E-089．115873015GO：0007165signaltransductionBiologicalprocess7．79283E．108．15352E．089．108305028GO：000150lGO：0032502SkeIetaIsystemdevelop二emBiologic融processl·63674E-091．66493E-078．786020553developmental’Biologicalprocess1．79142E。091．76892E．078．746801454processGO：0022402cellcycleprocessBiologicalprocess1,83558E．091．76892E．078,736226973GO：0022403cellcyclephaseBiologicalprocess2．60749E．092．4441f-078．583777217GO：0007409axonogenesisGO：0034097他sponset0。ytokinestimulusGO：0007049cellcycletypeIinterferon—GO：0060337mediatedsignalingpathwayG0：0071357cellularresponsetotypeIinterferonBiologicalprocess2．66969E-092A441E-078．573539476Biologicalprocess2．9684E一092．65129E．078．527477459Biologicalprocess3．87181E．093．37585E-078．412085413Biologicalprocess4．12143E-093．43015E．078．384952418Biologicalprocess4．12143E-093．43015E．078．384952418GO：0007275multiceUularBiologicalprocess4,36557E．093．5526E-078．359959419————————————————————————————————————————一——49 organismaldevelopmentGO：0007411axonguidanceresponsetotypeIGO：0034340i·nt．erI—eronBiologicalprocess4．79062E-093．81375E-078．31960848Biologicalprocess5．29518E-094．12573E-078．276119338GO：0022607∞nm誓∞唧呲mBiologicalprocess1．19163E．089．09117E．077．923857319assemt)lyGO：0034330∞儿Jund：onBiologicalprocess1．29699E．089．69302E·077．887062937OrgamzatlonGO：0048812n。?np喇ec．ti∞Biologicalprocess1．504E．081．10153E一067．822753537表3-2下调表达mRNA基因-生物学进程(前50个)GO．IDTermOntologyPvalueFDREnrichment·ScoreBiologicalGO：0003012musclesystemprocess—processBiologicalGO：0006936musclecontraction—processBiologicalGO：0030049musclefilamentsliding—processactin．myosinfilamentBiologicalGo：0033275·idingslKIlngp—rocessUU055actin-mediatedcellBiologicalG0：0070252．contractionprocessactinfilament-basedBiologicalGO：0030048movementprocessmuscleorganBiologicalGO：0007517d·eve·loomeIlt—p⋯r70C—I—BS—S—musclestructureBiologicalG0：0061061．developmentproces5striatedmuscleBiologicalGO：0006941．contractionprocessoxidation．reductionBiologicalGO：0055114．．．processproces5actinfilament．basedBiologicalG0：0030029proprocessptUU—c⋯55griatedmuscletissueBiologicalGO：0014706d-eve·lopment·pr⋯,oce—s—s—BiologicaiGO：0003008systemprocesSDrocess1．68797E-476．18136E．4446．772634521．82074E-463．33378E．4345．739751281．35015EG79．88853E-3536．86961674I．35015E．379．88853E．3536．869616741．35015E．379．88853E．3536．869616741．69563E．321．0349E．2931．770667952．8359lE．321．48358E-2931．547308184．66773E．322．13665E．2931．330894361．8128E．237．37608E-2122．741650173．78134E-191．38473E一1618．422353841．31306E．164．37131E．1415．881714145．08929E．161．55308E一1315．293342776．05058E．161．7044E．1315．21820326muscletissueBiologicaJ7．10648E．161．85885E．1315．14834544GO：0060537devel。pment里望!!翌—二———一————————————————————二_———————————————————————————————一。50 博士学位论文第三章GO：0044057GO：0050879Go：0050881regulationofsystemprocessgenerationofprecursormetabolitesandenergymulticellularorganismalmovementmusculoskeletalmovementGO：0030239myofibrilassemblyG0：0055002GO：0044281GO：0007519GO-0003009striatedmusclecel】developmentsmallmoleculemetabolicprocessskeletaJmuscletissuedevelopmentskeletalmusclecontractionBiologicalprocessBiologicalprocessBiologicalprocessBiologicalprocessBiologicalprocessBiologicalprocessBiologicalpro《gessBiologicalprocessBiologicalprocessGo：00l5980oXiiionofo曜锄乏两讲ogkalc唧oundspmcessG0：005500lmusclecellBiologicaldevelopmentprocessGo：0042692musclecellBiologicaldifierentiationprocessG0：0090257regulationofmuscl。BiologicalsystemprocessGO：0060538SkeIeta】舢cle呜anBiologica】developmentprocessGo：005l146s仃iatedmusclecellBiologicaldifferentiationprocessGo：0006006glucosemetabolicBiologicalprocessGo：o006937陀gulationof郴cleBiologicalcontractionprocessG0：0031032砒myosins眦恤BiologicalorganizationprocessG0：0003015heartDrocessBiologicalprocessGo：0060047heaItcontractionBioIogicaIprocessGO：0034637celIularcarbohyd‘ateBiologicai2．13703E．155．2172lE．1314．670188512．88902E一146．61224E．1213．539249971．31538E-122．67606E．1011．880949891．31538E-122，67606E．10l1．880949892．7567lE-125．31319E—1011．559609323．06289E一125．60816E-1011．513868083．52267E-126．14287E-1011．4531279l6．62259E-121．10236E一0911．17897199。2149lE—121．46717E．0911．035508861．18173E—111．78591E．0910．927480041．2281E-111．78591E．0910．910767171．26798E一111．78591E-0910．896886081．59855E一1l2．1681E-0910．796274791．69313E-112．21438E一0910．771308651．76376E．112．2272E．0910．753560913．01317E-113．67807E一0910．520976781．03427E一101．18903E．089．9853641751．03902E-101．i8903E．089．9833756781．47333E-101．58686E一089．8317001061．47333E一10l，58686E．089．8317001062．01431E-102．10754E一089．695874544GO：0043462regulationofATPaseBiological7．05485E-107．17635E-089．1515121915l 博士学位论文第三章52 博士学位论文第三章图3-l基因富集数量最多的生物学进程(前10个)图3—2基因富集程度最高的生物学进程(前10个)actinfhn州-basedmovement⋯mwan—e卸mem■—■■_⋯一m”edevelopmem■—■■_sthatedmusclecontractm■●l。xidatiomreductmmcess■lr]丌r010203040EnrichmentSc萏34lu3lcomoonentcomplexGmitochondrialC。11ul盯7．03579E．050．001141117·．1526872020：0005740035790141／41202G．，．‘·envelooecomponent-一一—————————_———————————————————二———_————．_--——_。____-—____-_——————————_’——————-———_————。__-___·_-———。。。‘——‘———————————一57 博士学位论文第三章CellularG0：000581llipidparticle‘‘‘component．neuromuscularCellularG0：0031594junctioncomponentmitochondfialCeilularG0：0031966membranecomponentCellularGO：0043234proteincomplex‘。+’componentCellularGO：0031967organelleenvelope————componentdystrophin．associatedCellularGO：0016010一‘glycoproteincomplexcomponentCellularGO：0044422organellepart1’’。componentCellularGO：0031975envelope—component．calciumchannelCellularG0：0034704complexcomponentvoltage．gatedcalciumCellularGO：0005891一一channelcomplexcomponentmitochondfialiFinerCellularGO：0005743membranecomponentbasolateralplasmaCellularG0：0016323一membranecomponentmitochondrialouterCellularGO：000574lmembranecomponentorganelleinnerCellularGO：0019866一membranecomponentCellularGO：0043229intracellularorganellecomponentorganelleouterCellularGO：0031968一membranecomponentCellularGO：0043197dendriticspinecomponentCellularGO：0043226organelle—component8．63513E-050．0013580714．063731058．95028E．050．0013662344．04816332l0．0002487130．0036880593．604301420．0005289610．0076258543．2765763860．O006428790．0090176883．1918704320．0006689940．00913705l3．174577690．0007170990．0095429343．1444208110．0009207990．0119473653．0358352460．0012789330．0161894242．893152110．0017911270．022133212．7468736640．0021141260．025517012．6748691220．0023018420．0271512762．6379244340．0029216720．0336966182．5343685260．0031851880．035937232．4968649230．00388680．0429201952．4104078140．0042515010．0459693522．3714577380．0043982580．0465856332．356719280．004531880．0465932122．34372163 博士学位论文第三章图3-3基因富集数量最多的细胞组件图3-4基因富集程度最高的细胞组件exlTacel‘larma”hDrde_口ceousextracelkJarmatt=enrace一一一an■■■■■_emc⋯m．or-■■■■■lc。Ilagen■■■■■■■emceIlulannt—an■■■■■■“忙一ip-■■■l曲一memmne■■-c—mm—n■■l⋯dopasmicremm■ln510152．3在molecularfunction分子功能方面，上调表达mRNA基因中有107个基因富集于分子功能方面(表3—5)，下调表达mRNA基因中有93个基因富集于分子功能方面(表3—6)；图3．5显示基因富集数量最多的分子功能；图3-6显示基因富集程度最高的分子功能； 表3—5上调表达mRNA基因．分子功能(前50个)GO．IDTermOntologyPvalueFDREnrichment．Score—————————————————————————————————————————————一GO：0005515proteinbindingextracellularGO：0005201matrixstructuralconstituentMolecul盯2．90922E-172．57466E-1416．53622307functionM01ec妇1．02893E．104．55301E．089．987614269functionGO：0005102receptorbinding缸幽n．．．，⋯glycosaminoglycanMolecularGO：0005539．indinbmdmg1—1mct．on山lC【loIIMolecularGO：0001871patternb砌ingfunctionnoIvsaccharideMolecularGO：0030247：．。．·fun—iOmdlnKIunc[10l—lMolecularGO：0005178integrinbindingfunctionnroteincomolexMolecularGO：0032403：indin‘fun—ibindinguncllO—llcarbohydrateMolecularG0：0030246．bm·a·m·g。f1UrlC-I．I‘O一一IIIidenticalproteinMolecularGO：0042802．·di‘functibmdm!E7Llncno—I—lplatel。t·d。riV∞MolecularGO：0048407growthfactor觚ction1．67086E．073．95067E-056．7770607191．88507E．073．95067E一056．7246721352．67842E．073．95067E-056．5721209752．67842E．073．95067E-056．5721209753．96179E-075．00884E-056．402108227．07146E．076．96908E一056．1504908227．0872E．076．96908E-056．1495254111．55667E．060．0001377655．8078036954．11866E．060．0003313655．38524392n51qRs订1lcmraIm01eculeM01。cular5．6552lE-060．0004170725．247551231GO：0005198activi“劬ctionMolecular8．12648E一060．0005532265．090097345GO：0008201heparinbindingfunction’MoIe。um7．18123E．050．0045395614．143801364GO：0003779actinbindingfunction。7·’斗’nslnlsactinfil帅entMolecular0．0001894080．0111750573．722602265GO：O051015bindingfunction．nnl0R3RgrowthfactorM01。cular0．0002040170．0112846823．690333957GO：0019838bindingfunction61114peptidaseregulatorMoIecu蔚0．0002425080．0123591823．615273106GO：0061134activity。functionprotemdu黑箩deM01ccularo．0002538040．0123591823．595501619GO：0015035oxidoreduct雒efunctionu·uuu2)j6u斗u‘ulzjjylo二m．nnd々Rn，proteinMoIecul盯0．0002715460．0123591823．566157268G【)：0042803h。m。d嘶i刎。兰坐壁!!翌一 堡主兰堡笙苎一．——————————————————————————————一第三章———————一—————————————————一activityGO：0004866GO：0019904GO：0008092Go：0061135GO：0015036endopeptidaseMolecularinhibitoractivityfunctionproteindomainMolecularspecificbindingfunctioncytoskeletalMolecularproteinbindingfunctionendopeptidaseMolecularregulatoractivityfunctiondisulfideMolecularoxidoreductaSe劬ctionactivityGO：003041411．，functionactwttyoxidoreductaseactivity,actingonaMolecularGO：0016667．一一ffunctisulfurgroupOlonUlJdonorsstructuralMolecularGO：0005200constituemoffunctioncytoskeletonMolecularGO：0005488bindingfunctionSH3domainMolecularGO：0017124．．．．funclionbindingIUIIL；|IOlIoli(,osaccharyIMolecularGO：0004576。一。．⋯functitranstefaseactlVltyIUllldl,lU～Ilintrarno】ecularoxidoreductaseactivi¨MolecularGO：0016862·。V—functimterconverungJUiII,IU—IIketo—andGO：0050840G0：0046983enol-groupsextraceltularmatrixbindingproteindimerizationactivityMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularGO：0005109frizzledbindingfunctionL．ascorbicacidMolecularGO：0031418bindingfun．tibmdmgUIIULIU—110．0002793040．0123591823．5539235430．0003892220．0164029243．4098027010．0004088320．0164461943．3884551830．0004510850．0173569533．3457419440．000498t130．0183679163．3026721470．0005257530．0186116393．2792186370．000572270．0194791883．2423990740．0005969870．0195679143．2240349810．000746044O．0235803333．1272353070．0008043410．0236209113．0945596770．0008273990．0236209113．0822849280．0008273990．02362091l3．0822849280．0011163840．0308749822．9521865860．001319251O．0353799262．8796724070．0015557910．0404963342．8080486490．00251720．0636491942．599082318endopeptidaseMolecul盯0．0033660370．0810747592．472881078GO：0004175activity些c皇竺——61 博士学位论文第三章GO：0016641G0：001990lG0：0004867GO：0016853GO：0001664GO：0017147GO：0005080GO：0019900G0：007085lGO：0001948G0：0019865GO：0016706oxidoreductaseactivity,actingonMolecu协theCH—NH2group血nctionofdonors，oxygenasacceptorproteinkinaseMolecularbindingfunctionse彻e’typeMolecularendopeptidaSefunctioninhibitoractivityMolecularisomeraseactivity—functionG—protein-coupledMolecularreceptorbindingfunctionWnt．proteinMolecularbindingfunctionproteinkinaseCMolecularbindingfunctionMolecularl(inaSebindingfunctiongrowthfactorMolecularreceptorbindingfunctionglycoproteinMolecularbindingfunctionimmunoglobulinMolecularbindingfunctionoxidoreductaseactivity,actingonpaireddonors，withincorporationorreductionofmolecularoxygen，Molecular2．oxoglutarateasfunctiononedonor，andincorporationofoneatomeachofoxygenintobothdonorSGO：0015631tubulinbinding0．0033895660．0810747592．4698558780．0035621560．0829607282．4482871190．0040144990．0910982442．396368660．004133340．0914501492．383698860．0046207460．0973513262．3352879480．0046758910．0973513262．3301355940．0047300640．09735l3262．3251329430．0049682870．099930322．3037933150．0061389960．1191414442．2119026440．0061926630．1191414442．2081225810．0071986340．1337394382．1427499160．0072536640．1337394382．139442541Molecular0．007620559O．1376366222．118013185run．ionhyaluronicacidMol。。uk0．008914722O．1540702962．049892189GO：0005540bindingfunction7O·2‘一 表3-6下谓表述tuRNA基因一分于功能t雨，u个，——————————————————————————————————————一GO．IDTemOntologyPvalueFDREnrichment·ScOrenR3n7structuralconstituentMoleculaf5．39767E．294．77694E．2628．26779361(30：00083∞ofmuscJe‰ction‘。’nq2c”oskele诅lproteinM01。cul雒2．87308E．181．27134E．1517．54165275GO：0008092矗nding亿删on。1‘。’Molecum6．4629E．171．90656E．1416．18957252GO：0003779actinbindingfunction‘。’dqloxidoreductaseMolecum2．19238E-094．85063E．078．659085023GO：001649lactivitv如nction。Mole。ular1．06222E．071．88013E．056．973786452GO：0003774motoractivityfunction‘。cMole。ular1．21678E-060．0001794755．914787766GO：0003824catalytiactivitycfunctioninbindinMolecular3．27818E。060．0004144565．484366784GO：0005516calmodulginfunction。structuralm01ecul。M01ecular9．86443E。060．0010912535．005928022GO：0005198^●。activil3'lunctlonMole。u协1．23368E。050．0012131174．908797999GO：0005523tropomyosinbindingfmKtion。0n146micmfil锄entmot0。Molecular3．05978E．050．0027079034．514310212GO：0000146activitvfunction。Molecul甜8．846IE．050．0066794474．053248332GO：0005515proteinbinding缸nction‘facMolecuIar9．05688E-050．0066794474．043021534GO：0048037cofactorbindingfunctionoxidoreductase㈣4activity,actingonMolecular0．0001426780．009713083．845642963GO：0016614cH．OHgroupoffuncti。ndonorsoxidoreductaseactivity,actingontheG0：0016620aldeh)rdeorOXOgroupofdonors，NADorNADPasacceptorGO：0051015aetinfilamentbindingMolecuk0．0002995510．0189359143．523528969functionM01ecul甜0姗03867740．0228196523．412543functionoxidoreductasen16q03activity,actingonth。Mol。cular0．0004561180．0252290183．340922935GO：0016903alde姆deorOXO舯upfunctionofdonorsGn．nnl向；16oxidoreductaseMolecular0．0005584980．0290747353．252978586Go：0016616activi劬型!翌墨竺些塑塑 博士学位论文第三章GO：0004030GO：0004860G0：0046983GO：0019210CH—OHgroupofdonors．NADorNADPasacceptoraldehydedehydrogenase[NAD(P)+】activityproteinkinaseinhibitoractivityproteindimerizationactivitykinaseinhibitoractivityGO：0050662coenzymebindingGO：0016787hydrolaseactivityGO：0016208AMPbindingGO：0008017microtubulebindingcarboxylesteraseGO：0004091．．一activltyoxidoreductaseMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionGO：0016645cH端掣面offunctiondonorsMolecularGO：0004601peroxidase跹tiⅥtyfuncl[ionoxldoreductaseM01ecularGO：0016684activity,ac曲g叽如nctionGO：0004806GO：0004889peroxideasacceptortriglyceridelipaseactivitynicotinicacetylcholine．activatedcation．selectivechannelactivity0．0008151460．0400780243．0887644620．0010863870．0506027482．964015570．0012887380．0570266392．889835502O．0014763310．0622168252．8308161330．0017050530．0685896152．7682622220．0021724480．0835920182．6630506230．0028613740．1055131522．5434254320．003162163O．1084641772．5000158040．0032337910．1084641772．4902880120．0034544570。1084641772．4616202020．0036287080．1084641772．4402480．0036287080．1084641772．440248MoIecu协0．0037993l0．1084641772．420295252functionMolecuk0．0037993lO．1084641772．420295252functionGO：0005509calciumionbindingfi．mctionMolecularGO：0016298lipaseactivityfunctionidemicaloroteinMolecularGO：0042802．．一‘fu—tionOmolngInl／,U1)l0．0039750860．109070132．4006534770．004067022O．109070132．39072350．004787235O．1203814232．319915237GO：0005245voltage．gatedcalciumMolecular0．0048968710．1203814232．310081295一——————————————————————————————————————————————一64 苎主兰堡垒奎—————————壁channelactivityfunctionG0：0051539Go：ool6877GO：0016791GO：0030291GO：00425784iroll．4sulfurclusterMolecularbirldingfunctionligaseactivity,formingMolecularcarbon．sulfurbondsfunctionMolecularphosphataSeactiVit)，凡nctionprotemM01ecularserine／threoninekinase．．inhibitoractivityphosphoricesterMolecularhydrolaseactivityGO：0016209antioxidantactivityhydrolaseactivity,GO：0016788·ngonactiOnester·Dong·sn2陀GO：0016836hydro-lyaseactivityGO：0008191GO：0048551GO：0003730GO：0016878Go：0042803GO：0048306GO：0010576metalloendopeptidaseinhibitoractivitymetalloenzymeinhibitoractivitymRNA3’一UTRbindingacid—thiolligaseactivityproteinhomodimerizationactivitycalcium—dependentproteinbindingmetalloenzymeregulatoractivityfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunctionMolecularfunction0．0048968710．1203814232．3100812950．0057583450．1350569612．239702281O．0057990560．1350569612．2366427020．0059741760．1355678442．2237219730．0065495870．1378104212．】8378610．0065515830．1378104212．1836537470．0069641040．1378104212．1571347660．0070137630．1378104212．1540489070．007169850．1378104212．1444899490．007169850．13781042l2．1444899490．0073187460．1378104212．1355633520．0073187460．1378104212．135563352Molec妇O．00777882l0．1434220052．109086244functionMolecularfunctionMolecularfunction0．0089744920．1620903162．0469901220．0095528630．1690856842．01986642965 博士学位论文第三章图3-5基因富集数量最多的分子功能CourtProportionPie图3-6基因富集程度最高的分子功能mucturaconm一一uscle■■■■●■■■■■mmm却rotm—m■■■■l“m懒■■■■l一“一m⋯ctm■_一toroc[m_cat州⋯帅I“m。“nindin。lstrum一一c⋯ctml”一⋯osnmn。lmmofil⋯一oto⋯tmlr————T————1Tr———_r0510152025E眺h悻憎Score(409lmPvahk))II|n2．4对本实验第一部分得到的差异表达mRNA数据进行KEGG生物学途径分析(Pathwayanalysis)分析，设定的筛选标准为：P值耋0．05，分别得到这些差异表达mRNA的富集表达谱：上调的mRNA在34条基因通路中富集程度比较高(表3—7)，下调的mRNA在32条基因通路中富集程度比较高(表3—8)； 表3—7UpRegulatedmRNA-PathwaysEnrichmentPathwayIDDefinitionFisher．PValueFDRscorehsa045】2ECM‘receptor溅mction。H鲫oSapi。n8·．1122E-096．66176E．078．3859264122E-0901663hsa04512‘．‘(human)hsa04974hsa04510Proteindigestionandabsorption-H0mo1．28779E．06O．0001043115．890155sapiens(human)Focaladhesion．Homosapiens(human)3．63989E-060．0001965545．438912hsa04142Lysosome．Homosapiens(human)1．14958E-050．0004655814．93946hsa05146Amoebiasis．Homosapiens(human)1．87643E·050．0006079654．726667hsa04145Phagosome．Homosapiens(human)6．07976E-050．0016415364．216113hsa04l10Cellcycle．Homosapiens(human)8．8427E·050．0020464524．053415hsa05150hsa04666Staphyl。c。CCusau陀u8infe。tion·Homo0．000113235O．0022930073．94602sapiens(human)FcgammaR-medi疵dphagocyt05i8‘0．0005965010．010737023．224389Homosapiens(human)hs删oo三侧p蒜箸印纰d逸h。118’0．0011263930．018217042．94831Proteinprocessinginendoplasmichsa04141硎culum．H。mosapiensm哪砌hsa05140Leishmaniasis-Homosapiens(human)0．001236960．018217042．9076440．0014476820．01954372．839327hsaOOsteoclastdi仃erentiation。HOmo8apien50．0019604630．024430392．70764143800196046304430392707641hsao‘Ihuman)hsa05130hsa04670PathogenicEscherichiacoliin南。tion。O．002155195O．024938692．666513Homosapiens(human)Leukocytetransendothelialmi删伽’0．0045848650．048287522．338673Homosapiens(human)hsa05133Pertussis—Homosapiens(human)O．0050598910．048287522·295859hsaOVibriocholeraeinfection‘Homosapiens．2090．048287522．2952315100050672090048287521hsao．(human)hsa03030DNAreplication—Homosapiens(human)0．0054815210．049333692．261099hsa04620T011。1订(。_receptor5守almgp抽way。o．0090757090．077382362．042119Homosaplens(human)hsa0Rhe啪aIoidarnlritis—H0mo5api8潞一．⋯0066—0．081053891．999711532300100066501053hsa0．(human)Pathway8incancer‘HomosaplerIs0．016379620．11828681．785696hsa05200．：‘(human)hsa05162Measles．Homosapiens(human)O．01671197O．11828681．776972hsa00360Phenylalaninemetabolism—Homosapiens0．01752397O．11828681．756367———————————————_————————————————————————————————————————_——————————_———————————————————————————————。一67 博士学位论文第三章hsa0051lhsa04612(human)Otherglycandegradation-Homosapiens(human)Antigenprocessingandpresentation-Homosapiens(human)O．017523970．11828681．7563670．020056160．12996391．697752hsa048】Regulationofactinc”03k。l。ton。Homo．021330．1314一．670879001336410131451416hsa0481V’．02．SaDlensIlauman}hsa05164InfluenzaA—Homosapiens(human)Chagasdisease(Americanhsa05142trvD而anosoml·asl·s)．H—omosa—pl，ens(一，human))一J0．021908560．13145141．6593860．024709240．14296061．60714lhsa05152Tuberculosis—Homosapiens(human)0．02680603O．1497441．571767hsaOGlutathionemetabolism。Homosapiens，03150941O．17015081．501560480015094170150830130hsao+，u·l·(11umanlhsa05144Malaria．Homosapiens(human)0．034675540．18120761．459977hsa04514hsa04650Celladhesionmolecules(CAMs)一Homosapiens(human)Naturalkillercellmediatedcytotoxicity-Homosapiens(human)0．036440440．18447971．4384160．040541440．1967291．392101hsa05219Bladdercancer．Homosapiens(human、0．04128880．1967291．384168——————————————————————————_————_——————————————————_——————————————————————————————————————————————————一——查!：!旦竺竺垦!鲤!坐璺型垒：呈塑!塑EnrichmentPathwayIDDefinitionFish铲PValueFDRscorehsa05410hsa05414hsa04260hsa04530Hypertrophiccardiomyopathy(HCM)一Homosapiens(human)Dilatedcardiomyopathy—Homosapiens(human)6．6441IE．131．02984E．1012．177563．43503E．112．66215E．0910．46407Cardiacmusclecomraction-Homo2．32371E一081．20058E．067．633819sapiens(human)Tightjunction-Homosapiens(human)1．69762E-066．57829E一055．770159hsa000】OGlycolysis／Gluconeogenesis—Honlo，351E一050．000425787·．86217137351E48621／hsa000lO，一·Sa口lens{lluman)hsa00071hsa05416Fattyacidmetabolism—Homos印ie璐4．32647E．05O．0009589894．363866(human)Viralmyocarditis-Homo8apiens4．33092E—05O．0009589894．36342(human)hsaoArginineandpr01ineme协boli8m—Hom0．625E．050．001233461·．1961160330636625E4110hsa0．‘、．。U，·saDlens(human)功，mvatemetaboIism‘Homo5印i。n8．一114129一．00196⋯一·．942605hsa006200000114129019655523942005_‘●．，lnumanlhsa04910Insulinsignalingpathway’H0m。sapie璐O．000144202O．0022351293．841029(human) hsa05412hsa04920Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy(ARVC)一Homosapiens(human)Adipocytokinesignalingpathway—Homosapiens(human)0．0002479650．0034940463．605610．0005210870．0062808383．28309Histidinemetabolism‘HomOs叩iens0．000526780．0062808383．278371hsa00340／，●Ihuman)hsa033201PAR?1印alingp甜1Way’H。m。8印knso．000669556o．0074129463．174213Ihumarl)Propanoatemetabolism‘Homo8apj。n80．0007995280．0082617913．097166(human)Valine，leucine锄disoleucinede删ati锄O．ool2494630．012104172．903277hsa00280．Homosapiens(human)U．Uu1洲hsa0Starchandsucrosemetabolism‘H0mo0．0013768010．012553192．8611290500hsao．，．、saolens(11uman)hsa0056lhsa00020Glycerolipidmetabolism—Homosapiens(human)Citratecycle(TCAcycle)-Homosapiens(human)0．0029221830．024406542．5342930．003084560．024406542．510807hsanTryptophanmetabolism。H0mo5ap鼬0．003149230．024406542．5017960380hsa0．【human)hsa05144Malaria．Homos印iem(human)0．0033199130．024504122．478873hsa00350hsa04020hsa00360hsa00410hsa05010hsa00260hsa04973hsa05143hsa04930Tyrosine(human)Calciummetabolism。Homosapie璐O．0036397120．025643422．438933signalingpmhway‘Homo0．0065837670．044368862．181526sapiens(human)Phenylalaninemetabolism‘Hom00．0084921880．054845382．07098sapiens(human)beta-Alaninemetabolism-Homo8apien80．0095786310．059387512．018697(human)Alzheimefsdisease。Homo8apiens0．018393880．10965581．735327(human)Glycine，serineandthreoninemetabolism—Homosapiens(human)Carbohydratedigestionandabsorption—Homosapiens(human)Africantrypanosomiasis-Homosapiens(human)TypeIIdiabetesmellitus。Homosapiens(human)0．01952670．11209771．7093710．020517040．11357641．6878850．0279080．14916341．5542710．03026468O．15636751．519064Salivarysecretion。HomOs叩iensO．031722860．15861431．498628hsa04970，．、U·l，lnUmallJh。。nMineralabsorption’H0mo8api。n80．03928870．19030461．4057324978hsa0，．，‘o‘!皇竺里竺2．一 堡主兰垡丝壅兰三兰2．5对本实验第一部分得到的差异表达lncRNA数据选取差异表达倍数较大的12个lncRNA基因(表3．9)，并与其227个目标靶编码蛋白基因(表3—10)构建一个编码．非编码基因共表达网络图(图3—9)表3-912个IncRNAs基因SEQ_IDFDRp-valueFoldchangeregulationASLNC238442．153E．051．3136E-095．88796ASLNC218680．00176988．27467E·075．7517543ASLNC240790．0078774I．72993E-055．217446ASLNC024190．02202250．000128083．9984086BE5036550．02860790．0002635153．3220236BC0506420,00621371．05183E．052．8265133ASLNC04683O．02202250．00013434122．388136ASLNCll435O．034544O．00039287111．647422ASLNC082480．03799130．0005003126．6065974ASLNC233390．00849151．91658E-055．074055ASLNCl33870．02749740．0002375643．6517124updownASLNC003390．0841413O．0024870923．17221down表3．10227个编码蛋白基因ACADVLBOLA2BMIFMDFIRCN3SGCAA》√IPDlCAPN3CHRNAlCLCNlCOLlAlCOLlA2SPPlMYBPCIPYGMHHATLSYPL2SLCl6A3RHOCTNNT3XIRP2DUSP27FTLDMPKMYF6MYH6～【YH8MYoGPDK4PGMlHTRAlABCC9ARPCIBKIF20ARHOUMYOZlSTl4MYHlVKORClTCⅡtG1DUSP26HDAC4TMEM38AMRC2PLA2G4A 博士学位论文第三章7l 博士学位论文第三章表3-11lncRNA基因与编码蛋白基因的正负PCC关系 GAAGAⅣ盯GAMTHADHBMYH7PFlo讧PFKMPLODlPTHlRSPTBCOL5A2G6PDMYL2TWISTlAKlALPLC1QBRYRlR豫jRYRlASLNC23339—0．953048020876545ASLNC046830．975202041883617ASLNCll4350．972668596802153ASLNC046830．951061795147041ASLNCl1435O．969558553544345ASLNC233390．972575678144772ASLNC046830．989346817636455ASLNCl14350．972275262291601ASLNC233390．973217837864094ASLNC238440．950300078398045ASLNC024190．955114411819959ASLNC240790．959111043806279ASLNC046830．974490245762837ASLNCl14350．961421700410916ASLNC233390．970056412690242ASLNC238440．965983825244921ASU呵C04683-O．953923854665181ASLNC233390．961924836670018ASLNC024190．95986369920314lASLNC23339O．964079288350119ASLNC024190．961150105746559ASLNC240790．964352472207995ASLNC04683-0．97021441620414ASLNCl1435—0．974552011626595ASLNC23339．0．958251195009961ASLNC046830．98263724341866ASLNCll4350．95918418025733ASLNC233390．969192614592706TGFBlASLNC238440．95714040313692273．+一+．_+ 博士学位论文第三章74 博士学位论文第三章M【『RCMURCZMYNDl7lFITM5FAMl34BSCNlBNPMlBOLA2BSPPlSYPL2SLCl6A3RHoCTNNT3XIRP2DUSP27ASLNC1l4350．970655462161776ASLNC233390．95119797365l537ASLNC046830．956876070708763ASLNC024190．953197673095588ASLNCll4350．960512172622974ASU、iC046830．955727017815811ASLNCl14350．9640030884l3668ASLNC238440．974917676928118ASLN(204683．0．951631609335455ASLNC23339．0．97227205284608lASLNC218680．955076104739305ASLNC238440。955028842788866AS【，NC046830．965706883217316ASLNCll4350．955261974172437ASLNC218680．958947986501437ASLNC23339-0．953135867020996ASLNC233390．959683978832175ASLNC23844-0．973246634247251ASLNC233390．957080220602072ASLNC046830．976570219725965DUSP27ASLNCl1435O．975658005908084DUSP27ASLNC233390．954481648061142DM咿KDⅣmKCADMlASLNC046830．97181071847346ASLNCl14350．960698394293446ASLNC024190．961900777631706CADMIASLNC24079O．953082232568921oBSCN0BSCNASLNC046830．964120571111524ASLNCl14350．962633656930442MAGED4ASLNC238440．96036759005038775+一十+一+．+ 博士学位论文第三章ACTAIASUNC233390．956570049407152～【YH2VSIG4ACP5SYNP02LSMlNL2SMTNL2SMlNL2MAPTTNNTlRRADANKRD2NT5DC2ASLNC233390．960729576804399ASLNC04683．0．954324584814413ASLNC238440．964743382887732ASLNC233390．967385923421993ASLNC046830．958039055778974ASLNCl14350．973745268046263ASLNC233390．9504070518856llASLNC046830．96318380148477lASLNCll4350．962835302431304ASLNC046830．971110661457308ASLNCll4350．966379037327469ASLNC233390．971593818327427ASLNC046830．972501697952402ASLNCll4350．976448979443752ASLNC233390．970615957688514ASLNC046830．956564884634976ASLNC233390．961147454360593ASLNC23844-0．957962615428702BE5036550．959688925383174PPP3CBASLNC046830．964050753629014IP6K3TPM2TNNl2CASQlCASQ2ASLNCl14350．952387840568528ASLNC046830．974354897235243ASLNCl14350．955949965910586ASLNC233390．959131107357315ASLNC046830．977229505435335ASLNC114350．975832795502176ASLNC233390．962478663724439ASLNC23844—0．95246488888630576+一+_+． 博士学位论文第三章CAV3ASLNC046830．980880065165069ASLNCll4350．979999640001751ASLNC233390．982859951749828SERPINHlASLNC23844O．960180496618778CD68ACTGlRHoGCAPGCKMCKMT2ASLNC23339-O．955331104034782ASLNC238440．951591125514146BE5036550．953926853308065ASLNC23339．0．953724431568757ASLNC238440．956588062264416ASLNC233390．971482120047866ASLNC046830．95772303228567COL6A1ASLNC04683-0．955520452473538COL6AIASLNC23339-0．961788898966202COL6A1ASLNC238440．953442086695076COL6A2ASLNC23844O．960828656007696COLl6AlCOLl6A1ASLNC04683-O．965610984450738ASLNC23339—0．968392553236324COLl6AIASLNC238440．956045576076357CRYABASLNC23844-0．957088032460996CTSDASLNC23339一O．95251588963594ASLNC23844O．970764141346151EEFlA2ASLNC04683O．978514061993796EEFlA2ASLNCll4350．967791009789642EEFIA2ASLNC233390．972815313869255EN03ACSLlASLNC04683O．957064822437124ASLNCl1435O．95032936304721ASLNC233390．970134617341379BE503655-O．951595657012989HRCASLNC046830．961460287524168+一+．+-+．一+一+．+ 博士学位论文第三章 博士学位论文第三章SLNSV【LSVILNFE2LlTNNC2TNNCl1_NNClHSP90BlUCP3CSDATCAPAOC3ASLNC23844．0．956979517226296ASLNC046830．986806292113188ASLNCl14350。963471739707026ASLNC233390．953879222467677ASLNC046830．950381587586603ASLNC046830．965200598156032ASLNC233390．962169114231672ASLl、lC046830．954816447234945ASLNC233390．961719731178773ASLNC218680．951952918178539ASLNC046830．979288690555913ASLNCl14350．951877182859825ASLNC23339ASLNCl1435O．950867446577893ASLNC23339O．954744098327955ASLNC23844-0．951042697602598ASLNC21868-0．9521637592493叭MYOMlASLNC046830．957707296667687MYOMIASLNC233390．974482096150261MYOMIASLNC23844-0．959457443651606MYOM2BINlASLNC046830，982140049522042ASLNCll4350．97449567991109ASLNC233390．970938506710851ASLNC04683O．977174125927084ASLNCI14350．957683089990954ASLNC23339O．976685643616047ARHGDIAASLNC04683-0．966064045186893ARHGDIAASLNC23339一O．960657779629046ATP2A1ASLNC046830．97779677847837．+十+．+．+．+ 博士学位论文第三章图3-9Coding-NoncodinggeneCo-expressionNetwork畴9√‘喝k+毋-4讨论÷静号e号一．，◆j。。审，峙·囊≯。誊誓黉零粤啼每毒?‘_音-je奇譬、、声、j-、◆⋯。。I一*ij：?辱．每．审-0-每本实验课题第一部分我们通过HumanLncRNAMicroarray芯片对9例骨肉瘤组织和正常癌旁组织进行基因表达谱分析，筛选在骨肉瘤中异常表达的基因，获得了在骨肉瘤中异常表达的lncRNA基因谱，国内外有很多关于IncRNA在恶性 博士学位论文第三章肿瘤中表达异常的报道，但是在骨肉瘤中研究尚属首次。在此基础上，为排除由于个体差异、组织异源性等因素引起的假阳性实验结果，通过增加实验的重复性和可靠性，第二部分我们应用实时荧光定量PCR技术对9例骨肉瘤组织和正常癌旁组织挑选了lO个lncRNAs基因：ASLNC21868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLN℃24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNCl8814进行RealTimePCR实验验证，验证结果显示HumanLncRNAMicroarray芯片芯片结果和实时荧光定量PCR结果一致，进一步证实了骨肉瘤中lncRNA的差异表达。已有研究表明IncRNA自身是非编码基因，并不能够通过翻译产生特定功能的蛋白质来发挥调控作用，而是依靠调控特定的靶基因或者改变构型等方式起作用。但是目前对lncRNA及mRNA基因的自身表达的调控及参与调控其他基因的网络途径缺乏了解，因此我们在本部分实验通过生物信息学技术来探讨异常表达的这些基因的功能分类和调节途径，构建靶基因与其调控IncRNA的网络关系图，为进一步研究这些异常表达基因在骨肉瘤的发生发展中的作用提供初步研究基础。我们通过对异常表达的mRNA基因谱进行GO分析，获得了异常表达的mRNA基因的功能分类分析结果。结果显示，在骨肉瘤中上调表达的mRNA有780个基因在生物学进程方面富集度较高，提示我们这780个基因涉及的功能分类主要是有关生物学进程，包括：细胞黏附、生物黏附、运动、细胞成分移动、对化学刺激的应答、免疫系统进程、对神经末梢刺激的应答、细胞迁移、趋化作用等；有116个基因在细胞组件方面富集度较高，涉及的主要功能分类包括：细胞外基质、胞外区、胶原、细胞胞壁外缘、细胞质膜、细胞质、内质网、锚固胶原蛋白等；有93个基因在分子功能方面富集度较高，涉及的主要功能分类包括：蛋白质结合、细胞外基质的结构组成、受体结合、葡萄糖胺聚糖粘合剂、整联蛋白结合、蛋白复合体结合、碳水化合物结合、识别蛋白结合、生长因子结合、结构分子结合、肝素结合等。而在下调表达的mRNA涉及的功能分类分析结果同样复杂，结果显示有617个基因在生物学进程方面富集度较高，提示我们这617个基因涉及的功能分类主要是有关生物学进程，包括：肌肉系统进程、肌肉收缩、肌丝滑动、肌动蛋白一肌球蛋白丝滑、肌动蛋白介导的肌肉收缩、肌肉组织器官发育、肌肉结构发育、横纹肌收缩、氧化还原过程等，有88个基因在细胞组件 博士学位论文第三章方面富集度较高，涉及的主要功能分类包括：收缩纤维、肌原纤维、肌原纤维小节、I带、细胞质、肌动蛋白细胞骨架、肌凝蛋白复合体、横纹肌细肌丝、肌球蛋白肌丝等，有107个基因在分子功能方面富集度较高，涉及的主要功能分类包括：肌肉结构组成、细胞骨架蛋白结合、肌动蛋白结合、还原氧化酶活性、运动活性、催化作用活性、钙调蛋白结合、结构分子活性、原肌球蛋白结合、微丝运动活性等。这些功能涉及到骨肉瘤细胞的生长、分化、凋亡以及整个细胞周期过程，由此可见整个调控机制的复杂性，这些差异表达的mRNA可能通过调节整个骨肉瘤细胞的多个生命过程来参与细胞的转化和恶变过程，而这些mRNA本身以及它们参与调控的途径均有可能成为骨肉瘤基因干预治疗的新靶点，针对某一个关键基因或者某一个关键途径基因的表达就可能抑制骨肉瘤细胞的癌变和进一步生长，因而可能具有潜在的临床应用意义。我们进一步对异常表达的mRNA基因谱进行KEGGPathway分析，获得了异常表达的mRNA基因所参与的细胞生命活动调节通路，上调表达的mRNA参与34条通路中，下调表达的mRNA参与32条通路中。在34条上调表达的mRNA参与的通路中，有9条通路与人类骨肉瘤数据库(www．hosdb．com)骨肉瘤相关通路吻合，包括：Focaladhesionpathway，Bladdercancerpathway，MAPKsignalingpathway，Toll—likereceptorsignalingpathway，Naturalkillercellmediatedcytotoxicitypathway，ECM·receptorinteractionpathway，FcgammaR-mediatedphagocytosispathway，Regulationofactincytoskeletonpathway，Ⅵralmyocarditispathway；在32条下调表达的mRNA参与的通路中，有2条通路与人类骨肉瘤数据库骨肉瘤相关通路吻合，包括Celladhesionmolecules(CAMs)pathway，TypeIIdiabetesmellituspathway。这些差异表达的mRNA涉及到的通路多种多样，其中包括：代谢途径(嘌呤嘧啶合成、固醇类物质合成)、肿瘤形成途径(膀胱癌、前列腺癌)、细胞黏附和链接途径、细胞生长途径、Wnt途径等，众多途径可能组成错综复杂的调控网络共同参与骨肉瘤的形成及生长。电压依耐性钾离子通道(Theetherago．go，EAG)在多种恶性肿瘤中均有表达，最新研究显示它能扮演癌基因的角色促进骨肉瘤细胞的增殖，而MAPKsignalingpathway通过调节EAG的表达来调控骨肉瘤细胞的生长【55]。有研究报道Focaladhesionpathway(图3．10)参与对骨肉瘤生长的调控，并且和骨肉瘤的预后有一定的联系[561。 博士学位论文第三章另外，Celladhesionmolecules(CAMs)pathway也有相关报道，研究称Celladhesionmolecules在调节骨肉瘤细胞系的增殖和转移中发挥关键作用[57】。这些研究结果进一步支持骨肉瘤发生及生长过程中这些复杂通路的调控存在，但是其具体的机制尚不清楚，对这些通路的进一步研究也许对研发干预骨肉瘤靶基因治疗具有重大意义。图3-10Focaladhesionpathway同时，我们还对本实验第一部分得到的差异表达IncRNA数据选取差异表达倍数较大的12个lncRNAs基因ASLNC02419，ASLNC21868，ASLNC23844，ASLNC24079，BC050642，BE503655，ASLNC00339，ASLNC04683，ASLNC08248，ASLNCl1435，ASLNCl3387，ASLNC23339与其227个目标靶编码蛋白基因构建一个编码一非编码基因共表达网络图，在这个网络图中，这12个lncRNAs基因和227个目标靶蛋白基因一个组成了393个相关连接，其中327个呈正相关，66个呈负相关，一个lncRNA最多有122个目标靶蛋白基因与其相关，而一个目标靶蛋白基因则最多和3个lncRNAs基因相关联。在这12个lncRNAs基因里面，有我们前面提到的有证据支持参与调控骨肉瘤发生的IncRNA基因BC050642[491，与PTPN6，RAC2，EGFL63个目标靶蛋白基因与其正相关，PCC系数分别为+0．973702，+0．952191，+0．955127，一定程度上说 博士学位论文第三章明它们之间联系密切。从这个编码．菲编码基因共表达网络图中我们可以看出其调控机制是非常复杂的，一个lncRNA不止调控一个目标靶蛋白基因，一个靶蛋白基因也不止被一个IncRNA所调控，然而本课题仅仅是初步的研究探讨，它{{’]之间潜在的奥秘及具体参与调控骨肉瘤的机制有待更进一步的研究去揭示。LncRNA目前已成为既MicroRNA之后研究各种疾病发病机制的热点，特别是在肿瘤研究方面取得了很大进步，但是仍然有很多问题尚未清楚。LncRNA不仅能影响基因编码蛋白质的功能，还有参与表观调节传递内在信息及其它功能，这远比我们之前预期的更为复杂。本课题采用基因芯片技术对骨肉瘤组织以及正常癌旁组织差异表达lncRNA基因进行筛选和初步研究，下一步研究将深入探讨它们在骨肉瘤发生发展中的作用和机制，希望为进一步发现新的骨肉瘤肿瘤标志物及骨肉瘤治疗研究提供科学依据和线索。5小结(1)GO分析显示，在差异表达的rnRNA中，上调表达的有617个参与BiologicalProcess，下调表达的有780个参与BiologicalProcess；上调表达的有88个参与CellularComponent，下调表达的有116个参与CellularComponent；上调表达的有107个参与MolecularFunction，下调表达的有93个参与MolecularFunction；(2)Pathway分析显示，有34条基因通路与上调表达的mRNA相关，有32条基因通路与下调表达的mRNA相关：(3)通过计算相关系数，得到12个lncRNAs基因和227个相关编码蛋白基因，建立一个初步分析IncRNA参与调控骨肉瘤发生及发展的基因网络图84 博士学位论文全文小结1．Microarray基因芯片是筛选差异表达lncRNA和mRNA的一种理想有效的方法；2．首次利用Microarray基因芯片研究骨肉瘤的lncRNA基因异常表达谱；基因芯片检测结果显示，骨肉瘤组织组和对照癌旁组织组相比，有1201个lncRNA表达有差异，其中上调表达403个，下调表达798个；同时检测到有1919个mRNA表达有差异，其中上调表达986个，下调表达933个；3．利用实时荧光定量PCR对在骨肉瘤组织中的异常表达的lncRNA基因：ASLNC2l868，ASLNC22124，ASLNC23844，ASLNC24587，BE503655，BC050642，ASLNC00339，ASLNCll435，ASLNCl3387，ASLNCl8814进行检测，实时荧光定量PCR结果与芯片结果一致，进一步提高了芯片结果的可靠性；4．GO分析显示，在差异表达的mRNA中，上调表达的有617个参与BiologicalProcess，下调表达的有780个参与BiologicalProcess：上调表达的有88个参与CellularComponent，下调表达的有116个参与CellularComponent：上调表达的有107个参与MolecularFunction，下调表达的有93个参与MolecularFunction；5．Pathway分析显示，有34条基因通路与上调表达的mRNA相关，有32条基因通路与下调表达的mRNA相关；6．通过计算相关系数，得到12个IncRNA基因和227个相关编码蛋白基因，建立一个初步分析IncRNA参与调控骨肉瘤发生及发展的基因网络图 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博士学位论文综述长链非编码RNA的研究现状摘要：长链非编码RNA(10ngnoncodingRNA)因其在生物基因调控方面的潜在巨大的作用在近几年获得科学界的广泛关注。研究显示长链非编码RNA和一系列的疾病发生及发展进程相关，但是其发挥作用的具体机制目前仍然不清楚，而且人们对整个基因组是否都存在转录生成功能性非编码转录本也仍然存在争议。人们从一部分研究较深入的长链非编码RNA那里了解到一些关于这些分子生物学意义的关键线索，同时长链非编码RNA的一些功能和作用机制也逐渐展现出来，虽然具体分类体系仍有待研究。本文里我们对长链非编码RNA的研究现状做一简单综述，讨论有关其起源、分类和在转录调节、基因表观调控以及疾病特别是在肿瘤中的作用。关键词：长链非编码RNA：基因表达；转录调控；肿瘤随着生命科学技术的不断发展进步，人们对RNA的了解发现其不再仅仅是遗传物质，除了编码蛋白RNA能够编码产生蛋白质外，非编码蛋白RNA虽然不具有翻译产生蛋白质的功能，但是却以复杂的调控机制参与生命活动。十年前，人们对RNA的认识仅限于-d,类管家RNA，包括核糖体RNA、转运RNA及剪接体RNA。而现在，大量的新的非编码RNA被发现，其中很多短链的非编码RNA正在按它们的长度、起源、结构特征和功能特征等被分类和命名，例如microRNA、piRNA及大量的小干扰RNA[11。同时随着全长cDNA克隆及序列分析和基因组微阵列技术的发展应用，数目庞大的长链非编码RNA(≥200碱基对)也逐渐展现在世人眼前【2]。长链非编码RNA(10ngnoncodingRNAs，lncRNA)是一种和信使RNA(mRNA)结构相似的、缺乏开放阅读编码框(openreadingframes，ORF)并且长度大于200个碱基对而不属于任何一种已知的非编码RNA的细胞内RNA[3]。长链非编码RNA按照位置结构可分为五种：(1)正义(sense)； 博士学位论文(2)反义(antisense)；(3)双向(bidirectional)；(4)基因内(inlronie)；(5)基因问(intergenic)[朝。在真核细胞生物中，大约5％一30％的转录单位是顺义．自然反义转录本，其中这个精确的百分比要根据参与转录序列的数量来确定【4】。这些数目庞大的长链非编码RNA中有多少是参与生命活动的?又有多少只是“转录噪音”?这个问题只有我们真正发现并积累各种各样的长链非编码RNA参与分子活动的实例才能回答。当然我们还是能够从理论上去推断长链非编码RNA长期进化后的功能。假如这些长链非编码RNA在不同组织、不同的生长时期的表达量保持恒定，或者这些RNA序列的突变率都没有差别的话，那么其长期的进化看起来意义不大，没有太多的生物功能。令人鼓舞的是研究证实，相当数量的长链非编码RNA在不同的组织或者不同的时期其表达水平不同，甚至会受到其他物质的影响而表达水平变化，例如视黄酸[5，6]。但是，这些实验也暗示长链非编码RNA的表达也只是可能具有调节功能，不能完全排除偶然性的可能。为了研究这个问题，有学者将人和大猩猩的基因间长链非编码RNA表达水平的进化做比较。他们认为如果基因间长链非编码RNA的表达水平的变化和变化的模式在人和大猩猩的三种组织(脑、心脏和睾丸)一样的话那么这些RNA拥有的生物学作用是微乎其微的。结果显示，长链非编码RNA的表达水平在两种不同的生物显著不同，它们变化的趋势也不同。虽然基因变异可能也会一定程度上起到这样的作用，但是研究者相信基因间长链非编码RNA能像编码蛋白RNA一样参与生命活动并起到一定的作用f7]。进化论研究最开始认为非编码RNA序列不具有生物学功能，因为他们像其他基因间序列一样低度保守【8】。但是近年来，Ponjavie【91等在研究中描述了一个含3122个碱基对的非编码RNA与编码蛋白RNA相关功能的特征，这些非编码RNA无论是在启动子还是序列本身同样有核苷酸置换、插入和缺失的现象。更进一步的是，它们核苷酸连接位点比预期的更多的保留下来。相反的是，那些存在于非编码RNA序列本身内部的可换位的转录元件并没有证据表明有核苷酸置换的现象。因此，我们认为这些非编码RNA看起来像是经过千百年的进化后生物学功能开始展现在世人面前。进化论研究暗示我们这些众多尚未被认识的非编码RNA不仅仅只是“转录噪音”而已。到目前为止，长链非编码RNA的起源并不清楚。尽管大部分非编码RNA92 博士学位论文综述序列都只有低度的进化保真，但是仍然有少量的保守序列存在不同的物种之间，比如哺乳动物和鱼。尽管如此，-d,类非编码RNA也可能在一些特殊的物种出现并剧烈变化[10】。所以人们推断长链非编码RNA的进化起源和已知的编码蛋白RNA的进化起源是很不一样的。目前认为长链非编码RNA有多种不同的来源：(1)由编码蛋白基因断裂而形成一个合并有编码蛋白基因前体序列的长链非编码RNA。X染色体失活特异转录物(X-inactivation．specifictranscript，Xist)基因产生一种在真哺乳亚纲动物对x染色体失活起关键作用的长链非编码RNA．XistlncRNA，其被认为是蛋白编码基因Lnx3断裂后早期突变形成的[11]；(2)由两个未转录的序列和一个独立分离的序列经过染色体重构形成一个含有多个外显子的长链非编码RNA。一条来源于狗睾丸的长链非编码RNA正是经过这样的过程由BM537447、C0597044和DN744681三个基因重构而来【3】；(3)由非编码基因的反转录复制而产生的有功能或者无功能的非编码RNA[3，12】；(4)由邻近的复制子串联复制而形成【3】；(5)由转座子的插入而形成[3，13】。长链非编码RNA在很多不同的组织中被人们发现，它很多时候和mRNA相似，大部分在大脑中表达[14】。在大脑中表达的长链非编码RNA的时空特异性可以是很精确的，比如在正在发育的大脑中特异表达的Evf2长链非编码RNA[141。长链非编码RNA的细胞内定位也和那些编码蛋白RNA一样展现出多种类的亚细胞结构模式。通过对AllenMouseBrian数据库中超过800条长链非编码RNA的分析，Mercer[14]等人观察到其分布在胞核、胞体及小脑浦肯野细胞一个或多个位点。其中一些还被发现有不同于一般的甚至是独一无二的细胞亚结构。例如日本学者发现的Gomafu长链非编码RNA，唯一位于核小点上的且被多腺核苷酸化的RNA。Gomafu长链非编码RNA的核内表达给人们对细胞核内亚结构展示了一片新的领域【15】。大部分的长链非编码RNA和已知短非编码RNA(小于200个碱基对)一样，在远离5’端或者3’末端的位置转录，但是也有一部分长链非编码RNA转录聚集在启动子基因或者外显子和内含子基因的附近[2】。虽然这些长链非编码RNA可能只是基因转录起始或者停顿落空的产物，但是它们可能对应短非编码RNA转录后加工来源途径。大约95％的转录序列位于这些长链非编码RNA或者短非编码RNA中，但是不会同时位于两者里，长链非编码是如何被大量转录加工还需要我们去研究【9】。传统上认为一般小非编93 博士学位论文码RNA定位于内含子，比如一些miRNAs和snoRNAs。但是最近有研究显示，利用大范围的转录检测和电脑分析，许多长链非编码转录本也在已知基因内含子中被编码产生【16，171。这些长链非编码RNA中在应答外界刺激或者在恶性肿瘤中异常表达，展现出不同的表达模式，但是当中只有很小的一部分被人们重视并开始研究[18】，长链非编码RNA，COLDAIR．位于开花抑制基因(floweringrepressorlocus，FLC)的第一个内含予上，研究显示其参与植物开花催熟过程[191。相对于含有高密集功能序列的短非编码RNA来说，那些有生物学功能的长链非编码RNA是冗长的，且这些功能区序列并不能够从长链非编码RNA的转录加工中区分识别。但是可能可以通过对短茎环二级结构的预测来精确定位其功能序列。关于解决长链非编码RNA二级结构这个问题的方法现在集中于记录评估在保守序列里配对的碱基对发生的明显代偿的突变。但是高灵敏高特异预测评价茎环二级结构的技术还在摸索当中[201。和编码蛋白RNA比较，这些在动物基因组编码产生非编码RNA的基因元件的数目及范围还没有明确，能确定的是这些长链非编码RNA和我们预想的一样不存在编码序列区，而是定位在基因间、基因内及非翻译(untranslationregion,，．UTR)序yrJ[20]。传统观点认为真核生物的基因调节是由蛋白之间直接的反应或者是蛋白和DNA的作用控制的。但是现在已经明确这个调控网络其实更加复杂，RNA和蛋白质、DNA的某些特定的相互作用也是很重要的方面[2l】。长链非编码RNA已知的调控作用分为有顺式作用和反式作用。长链非编码RNA转录的基因组定位是其调控作用潜力大小的一个重要因素。顺式作用元件及其他外显子RNA序列多来源于编码蛋白的基因位点本身或附近【22，231。如果多个启动子位子一个基因附近，那么由它们启动的转录可能就会有一个协同调节作用，这个协同调节作用可能通过染色质的重构来实现[24】。当一个转录过程通过一个启动子序列传递延伸时，可能会对这个启动子启动下一个转录产生抑制作用【25】。研究发现在酵母菌SER3基因转录的过程中，每当它上游的SRGl长链非编码RNA被激活或者过表达的时候转录就会受到抑制【26】。这种在调节表达水平以顺式作用形式的转录干扰被认为是长链非编码RNA调控功能的通用模式，这是因为不管是长链非编码RNA在启动子序列的高度保真还是在转录本序列的低度保真都一致的吻合了一个事实，那就是转录本身比转录序列具有更重要的生理意义[9，221。 博士学位论文综述器官的发育是一个精细调节、多因素参与非常复杂的一个过程，基因表达的时空特异性和蛋白质的水平决定了一个干细胞或者一簇细胞群的发展命运。基因表达水平的改变或者一些关键基因的时空表达错误都可能造成发育的改变。转录过程就是一个转录因子与远处的转录控制元件结合，染色体重构因子不断激活恢复以促进与其他合作因子不断进行反应的过程。这样的转录机制大多数情况下需要严谨精确的转录调节，但是在一些特定情况下对某一个特殊的基因的活化或者沉默则不遵循这个基本原则。目前我们还没有发现可以特异调节某一个基因的调节因子。胚胎干细胞可以在体外培养发育成多能干细胞，这些细胞被认为没有固定的染色体结构从而使得能够多向分化，这个观点与在胚胎干细胞存在的广泛转录现象相符合[271。如同那些编码蛋白基因一样，长链非编码RNA在胚胎干细胞分化时的变化提示其在分化过程的重要作用【28】。长链非编码RNA在分化中的重要作用同样也体现在脑的发育【14】及T淋巴细胞的分化qb[291。这一系列的研究都提示～点，即长链非编码RNA在发育过程中扮演重要角色，人们后来又观察到长链非编码RNA参与多细胞器官的发育分化过程，这种分化多种不同的细胞由一些干细胞分化来源，更加证实了长链非编码RNA参与发育分化的作用。长链非编码RNA参与转录调控及机制还有很多其他的方式。长链非编码RNA的转录可能提高编码蛋白基因和RNA聚合酶的亲和力。在酵母菌体内，葡萄糖缺乏可以诱发fbpl基因和一些5’端上游长链非编码RNA出现。正是这些长链非编码RNA的转录破坏了染色质的结构并通过结合启动子区域促进了fbpl基因的表达【30】。同样的现象也发生在人类p一球蛋白基因的转录表达中[24】。长链非编码RNA序列还可以通过结合蛋白质或者DNA来发挥其调控作用。在人类二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)基因的表达中，长链非编码RNA通过同时结合DHFR基因启动子及转录因子IIB(transcriptionfactorIIB，TFIIB)导致转录起始启动子解聚抑制靶基因的转录。这种有一条长链非编码RNA和两个DHFR启动子形成的三聚体结构可能广泛存在于人类的启动子，但是这到底是不是一个具有普遍性的作用机制还有待研究[31】。长链非编码RNA也可以不结合DNA而直接以顺式作用其调控作用。有研究发现，细胞周期蛋白(cyclinDl，CCNDl)启动子上游的长链非编码RNA可以由电子射线诱发产生，这些长链非编码RNA与一种RNA结合蛋白TLS(translocatedinliposarcoma)结合通过和95 博士学位论文组蛋白乙酰转移酶的相互作用弓l起结构改变抑制CCNDl的转录[32】。研究者猜想这样的作用方式肯定还存在与其他的非编码RNA与RNA结合蛋白组合配对里。长链非编码RNA发挥作用的另一种形式就是形成核糖核蛋白复合体。核糖核蛋白复合体Evf2外显子位于Dlx5的下游，Dlx6的附近，Dlx5和Dlx6是神经系统发育重要的同源基因。Evf2由位于Dlx5和Dlx6之间的超保守元件转录而来并与另一个同源基因Dlx2结合形成，复合体激活Dlx5／6启动子的具体机制暂时还不清楚，可能直接作用于Evf2第二个外显子里的启动子基因。这种反馈循环的复杂复合结构给我们透彻理解长链非编码RNA怎样像编码蛋白基因一样起作用提供了帮助[33】。第三种通过与蛋白质结合发挥作用的长链非编码RNA是HSRl(heatshockPdqA一1)，长度约604个碱基对，同真核细胞转录延伸因子1A(translationelongationfactorlA)一起促进热休克蛋白因子1(heatshockfactorl，HSFl)的三聚体化[341。HSFI通过结合启动子来诱导热休克蛋白基因的转录，不仅仅复合体是由热刺激产生的，而且RNA干扰的HSFl基因敲除也能够使细胞变得具有热敏性[34]。长链非编码RNA还可以通过控制转录因子的亚细胞定位来起调控作用。长链非编码RNANRON(noncodingrepressorofNFAT)可能是通过与核内转运因子的相互作用来影响转录因子NFAT(nuelearfactorofactivatedTcells)的定位。敲除NRON基因后导致转录因子NFAT的数量增加及活性增强[35】。许多情况下长链非编码RNA是作为协同因子参与转录调节的，比如长链非编码R．NA7SK同延伸因子P．TEFb形成复合体来抑制由RNAPll酶调节的转录延伸【36，37]。长链非编码RNA有时候扮演细胞核组成元件的关键调控者的角色，在细胞核内部存在着许多具有重要功能的核小体(nuclearbodies)[38]。核仁是转录rRNA和结合核糖体的主要位点，同时也受pRNA的调节[39，401。在核仁周区室(preinucleolarcompartment．PNC)周围的核仁，可能发挥有别于传统核糖体起源论的作用，如同Xist和Kcnqlotl分别调节X染色体失活和Kcnql印迹区域一样定位调控核仁周区室(nuclearspeckle)区域从而维持沉默状态[41，42]。其他结构和功能的核小体同样的也包绕在RNA的周围。NEATl(nuclearenrichedadundanttranscript1)参与p嬲peckles的形成和维持其稳定性，而有研究报道paraspeckles能够通过对非编码区域存在A．to．I编辑(adenosine-to—inosinehyperediting)的 博士学位论文综述RNA滞留于核中，从而无法翻译成蛋白质以发挥生物学功fl皂[43，44]。NEATl能和paraspeckle蛋白P54／NONO、PSP发生反应[43，45，46]，最新证据表明募集这些蛋白质形成paraspeckles是一个动态的需要持续的转录产生NEATl的过程[47]。在NEATl附近，NEAT2和MALATl(metastasis．associatedlungadenocarcinomatranscript1)基因诱导丝氨酸／精氨酸剪接因子局部化聚集于一个叫做核散斑(nuclearspeckles)的亚核结构然后发生磷酸化反应[481。MALATl再次诱导这些剪接因子聚集到转录位点，到达转录位点以后开始剪接，研究者推断MALATl可能在调控某些特定的mRNA前体的剪接方面有重要作用[491。更深入一步的研究显示，MALATl能够和PRCl的亚结构Cbx4／Pc2反应，并同时参与激活和沉默基因在细胞核之间的穿梭作用。在细胞外生长信号因子存在的情况下，未甲基化的Cbx4和MALATl结合，和共同激活因子一起使它的目标靶基因定位在称为“转录工厂”的染色质间颗粒，这些染色质间颗粒通常在核仁周区室周围聚集。另外在有信号因子存在的情况下，Cbx4甲基化后不再与MALATl结合而是与另外一个长链非编码RNATUGI结合，作用于一些共同抑制物，比如EZH2，然后被转录成一种叫做多梳体(Polycombbodies)的沉默结构[50】。这个研究给我们展示了在信号通路、染色体重构调节因子、长链非编码RNA和核小体它们之问在调控基因表达方面存在的复杂的相互作用。一个最令人费解的是，尽管长链非编码RNANEATl或者是MALATl在生物体内存在的表达量高、与一些关键的亚细胞核结构的联系紧密，对它们进行基因敲除后生物体依然拥有明确的生物显型【51，52，53，54]，这些观察研究进一步增加了环绕在长链非编码RNA周围的神秘感，也说明了它们的数量多少和功能重要与否并不是必然联系的，同时也强调了基因传统的基因敲除实验对这些新发现的长链非编码RNA功能研究的重要性。长链非编码RNA还经常参与基因的表观修饰调节。表观遗传学的调节机制主要包括DNA甲基化、组蛋白甲基化或者乙酰化、泛素化等方式。最早引起人们对长链非编码RNA参与表观调节作用是哺乳动物身上发生的基因组印迹(genomicimpriting)和X染色体失活(xchromosomeinactivation)，同时H19和Xist基因也被人们发现并分别于前二者密切相关[55，56]。H19基因是一个母源表达而且基因印迹的长链非编码RNA，同时在胞内被剪接、多聚腺苷酸化后 博士学位论文输送到胞浆并在那蓄积较高浓度【57】。虽然H19是第一个被发现的在生长调节中起作用的长链非编码RNA，但是直到现在它的功能仍不明确。最近有研究发现H19基因是一个外显子microRNA-miR65的前体【58】，H19和micr065的一些共有特征同时被保留在兽亚纲哺乳动物身上超过一百五十万年，提示长链非编码H19可能通过miRNA发挥其作用[591。H19的功能仍需要更进一步的研究，另外一个令人感兴趣的是这个长链非编码RNA到底是如何被剪接、如何通过无义介导衰变途径从核内运出并避免被降解。实际上，核内mRNA关键成分的降低及无义介导衰变途径在胚胎干细胞分化时期可能对H19基因起调节作用[60]。另外一个经典的长链非编码RNA参与表观调节的是X染色体失活。Xist长链非编码RNA对哺乳动物的顺式X染色体失活是十分重要的[61】，同时它和H19存在着很多相同之处，比如都被剪接和多聚腺苷酸化修饰，都被一些相同的无义介导衰变途径调节。但是，它们也有明显不同的地方，它被修饰完后并没有像H19那样被输送到胞浆内，而是像RNA的一个结构域部分与即将失活的x染色体结合在一起【62】，以“外套”(coating)结构顺式作用方式介导基因沉默【56】。Xist长链非编码RNA通过在没有RNA聚合酶II(polII)的情况下形成一个特殊的核结构，大部分即将失活的X染色体在失活的过程中定位到这里【56]。有趣的是，“外套”(coating)即使是在有丝分裂的转位期也是稳定地与失活的X染色体相连，即使经历多次分裂，X染色体始终保持失活状态[631。在定位到Xist长链非编码RNA结构域之后，x染色体相关的基因开始失去激活的组蛋白化修饰，获得抑制的组蛋白化修饰并且开始被沉默。它们还会被变型的高分子组蛋白H2A混合物标记且定位到细胞核附近【“】。最近有研究显示，Xist长链非编码RNA其中的一个叫做Repa的小片段通过募集Polycomb抑制复合体2(Polycombrepressivecomplex2,PRC2)靶向定位Ezh2(PRC2的一个成分)使H3K27发生三甲基化，表明Repa对Xist长链非编码RNA及H3K27的甲基化是非常重要的[65】。最后，失活x染色体上启动子的许多CpG小岛甲基化，RNA“外套”(coating)结构和组蛋白修饰及DNA甲基化一起构成了基因的表观记-IL[64]。在多能干细胞在早期分化过程中，Xist长链非编码RNA对基因沉默和表观记忆的形成建立是非常关键的[66】。在体细胞中，Xist基因在没有重大基因沉默缺失的情况下也可能被去除，提示我们一旦关于DNA或者组蛋白甲基化的记忆建立起来，由长链非编 博士学位论文综述码RNA诱导的沉默结构域则不是必须的【67】。长链非编码RNA参与基因表观调节可能还与一些基因簇相关。哺乳动物基因组印迹基因簇包含了许多位于H19长链非编码附近的其它长链非编码RNA，这些长链非编码RNA大部分都能自身印迹[68]。这些长链非编码RNA中的-,5类可以通过基因簇发挥巨大的基因表观调节作用，其他的可能有局部功能。长链非编码RNAKcnqlotl，Air和Nespas三个基因是父源表达，通过对卵母细胞中启动子甲基化来抑制母系等位基因的表达[68]。这些长链非编码RNA基因簇剪接修饰很少出现，因为它们和DNA有着很好的线性对位，同DNA相对应，它们可能也很长[42，69，70】，可能它们在进化过程中失去了被剪接的功能以逃避无义介导衰变途径[3】。通过对长链非编码RNAAir和Kcnqlotl启动予的剔除[71】或者植入未成熟的聚合酶PolyA前体来实现对RNA的切断[72，73，74]，我们发现这些长链非编码RNA本身或者是它们的转录分别对Air和Kcnqlotl基因簇父源染色体上印迹基因的表观沉默是必要的，而且对于那些长度达到800kb的基因簇来说，这些长链非编码RNA对与它们获得抑制性组蛋白标志物和DNA甲基化也是必须的【75，76】。已经有一系列的模型解释长链非编码RNA是怎么样在基因簇中以顺式方式发挥表观基因沉默作用。基因簇同时也包含一些小RNA，其中一些也是由长链非编码RNA加工而来的[681。异染色质的局部形成过程提示我们RNA干扰途径也可能参与基因沉默的可能性，在基因水平上用条件性的敲除Dicer酶的方法来验证这个想法【3】。人们发现在长链非编码RNAKcnqlotl基因簇的印迹没有受到Dicer酶缺失的影响[69】，同样的情况也发生在x染色体失活【77]，但是在其他的研究发现x染色体失活明显受到一些小RNA通路的影响『78]。这样的情况我们可以把它理解成通过印迹长链非编码RNA基因的转录行为可能是很重要的，对这个猜想有力的证明就是有研究发现在长链非编码RNAlgf2r／Air启动子元件的转录可能对父源染色体上此基因本身的沉默非常关键【79】。另一方面，X染色体失活的许多相同特征提示我们是否常染色体上的长链非编码RNA也参与基因的表观沉默调节，一系列的研究验证了这个事实『42，69，75，80]。研究发现长链非编码RNAAir和Kcnqlotl，它们会建立一个核RNA域，与那些被顺式失活的基因紧密联系，而那些不受长链非编码RNA调节的基 博士学位论文因则在这个核RNA域的外面【80】。这些新发现提示我们在哺乳动物基因簇一些表观基因沉默的关键机制方面是同时存在于X染色体失活和常染色体印迹的。还有一种令人兴奋的可能就是长链非编码RNA域可能不仅能过以顺式发挥作用，还能以反式作用来参与基因表观沉默调节，与其相关的研究就是发现长链非编码RNAHOTAIR参与在HOX基因簇对目标基因的表观基因沉默和组蛋白标记[81】。长链非编码RNA它们能够自身锁定那些将要被失活区域的调节器这个想法相当吸引人，只不过要想实现并不容易，因为这些长链非编码RNA在建立核RNA域的同时将不可避免的去抑制染色体而且这些表观调节器也同样会调节抑制染色体[3】。另外一个联系长链非编码RNA和印迹基因DNA甲基化的发现就是通过印迹控制基因元件发生在长链非编码RNA的转录可以诱导这些基因元件的甲基化[82】。总的来说，长链非编码RNA所扮演的重要角色可能是在整个细胞有丝分裂期基因表观沉默或者激活的作用，同时维持多细胞生物细胞特征的稳定。除了涉及等位基因的调节之外，长链非编码RNA还参与发育的许多其他方面，比如调控细胞多能性和种族特异分化。研究显示X染色体失活的过程与早期胚胎发育之间存在一定的联系[831，这种联系也可以延伸到胚胎干细胞多能性分化[84】。一些多能性转录因子核心网络的成员，比如Oct4、Sox2和Naong等共同定位在Xist内含子．1185，86，87]，而且Oct4参与调节Tsix和Xite基因的表达，进而调控x染色体配对及诱导x染色体失活[861。最新研究显示Oct4和一系列细胞多能性相关长链非编码RNA的表达紧密联系，同时Oct4本身的表达也能够被长链非编码RNA的反义核苷酸片段所调节[881。研究还发现长链菲编码RNA参与调控动物的发育过程。HOX基因能够编码产生对多细胞动物很重要的转录因子[89】，这些转录因子聚集排列在染色体周围，哺乳动物一般存在四种类型：HOX-A、HOX．B、HOX-C和HOX．D。很多长链非编码RNA就是在这些基因簇中编码产生，比如HOTAIR来自HOX．C[811，HOTTP和Mistral来自HOX．A[90，911，这些长链非编码RNA被认为参与其附近或者远处的HOX基因的表达。另外，长链非编码RNA还参与神经系统的发育，Evf2基因和位于同源转录因子Dlx5和Dlx6之间的增强子紧密联系，而同源转录因子Dlx5和Dlx6已有体内基因敲除实验证实其能够在鼠前脑调节神经元细胞的发育，而且即能以100 博士学位论文综述顺式作用方式(抑制Dlx6)，又能以反式作用方式(激活Dlx5)发挥作用[92]。一些长链非编码RNA对神经胶质细胞的分化进化来说可能是必要，其作用机制可能是通过复活表观调节复合体，比如PRC21931。随着人们对长链非编码RNA功能的不断研究，发现长链非编码RNA与人类许多疾病密切相关，长链非编码RNA所调控基因的变化或者是长链非编码RNA本身的变化都有可能是引起疾病发生的的原因。大多数情况下，更多的证据集中在疾病和非疾病组对照之间的长链非编码RNA转录表达水平的差异[94】。例如，睑裂综合征(theblepharophimosissyndrome，BPES)是由FOXL2基因的表达失调引起的，但是最近有研究提示在睑裂综合征的发生过程中还有大量其它的基因突变存在[951，一条来自FOXL2基因长283个碱基对的片段破坏了能够与FOXL2形成茎环结构的长链非编码RNAPISRTl，提示这条长链非编码RNA可能与睑裂综合征的发病有关[96】。与长链非编码RNABC200或者是p—secretase一1(BACE)基因的反义转录链的升高都与阿尔茨海默病的病程进展相关[97，98】。同时，长链非编码RNA表达水平的改变和许多肿瘤的发生相关[99】，这个被许多人认为是其最具有生物意义的方面，一些初步的研究显示在胶质细胞瘤[100]、肝细胞癌[101】和前列腺癌002，10315b发现长链非编]L-'-'-马RNA表达水平的变化。一种叫做OCC．1(结肠癌过表达基因．1)的长链非编码RNA被发现在结肠癌细胞中表达升高[104]。长链非编码RNAMALAT-1是研究的比较多的肿瘤相关RNA，其同源基因在小鼠肝癌细胞中表达量升高[105]，且和多种恶性肿瘤的发生和转移密切相关『105，106]，研究显示其能够影响细胞支架和细胞基质基因的转录后转录后调节【107]。最近一项研究在前列腺癌组织中发现一种长链非编码RNA，PCAT-1，一方面它能够促进前列腺癌细胞的增殖，另一方面它也是PRC2复合体调节的靶点，同时可能能够与PRC2复合体本身发生反应[1031。长链非编码基因ANRIL，同样在前列腺癌中表达上调，通过对肿瘤抑制因子INK4a／p16和INK4a／p15的抑制作用参与肿瘤的调节[108，109]。一系列研究显示HOTAIR的高表达与乳腺癌[1t0]、肝癌[1ll】、结肠癌D12]、胃癌[113】、胰腺癌[114】的不良预后相关，并且促进肿瘤的恶性侵犯及远处转移[110]。长链非编码RNA，IncRNA-p21在DNA损害时被P53上调表达，并且参与下游基因对P53途径的抑制性调控，特别作用于那些调控凋亡的基因【115】。另外一个DNA损伤应答长链非编码RNA基因，由P53 博士学位论文诱导产生的位于P21上游一DNA损伤激活相关非编码RNA(P21associatedncRNADNAdamageactivated，P21．PANDA)，也同样参与对促凋亡基因的抑制，tL女r]FAS和BIK。在一些恶性肿瘤中，P53突变维系蛋白质的稳定和诱导PADNA调节通路(包括它的反凋亡作用)，同时其诱导p21的能力和对细胞周期阻滞的促进作用消失，这样就能增加肿瘤细胞的生存能力[116】。但是，长链非编码RNA表达水平的改变并不一定与疾病的发生有必然的联系。上述研究提示长链非编码RNA可能将来用于诊断治疗肿瘤的诊断标志物或者治疗靶点，但是在真正应用到临床实际工作中来还需要很多深入的研究。总之，受长链非编码RNA调节的信使RNA的变化正在成为疾病发生发展的一个热点研究，一些暂时没有被发现的长链非编码RNA可能对一些暂时无法解释的疾病具有重要的意义，就如同我们解释为什么在转移癌中长链非编码RNAHOTAIR大量增多是因为非编码RNA的变异[1171。一个转录本假如缺乏编码蛋白质的阅读编码框(openreadingframe，ORF)或者在体外转录实验中不能产生蛋白质一般就认为是非编码RNA[118，119，1201。但是，一个有趣的现象让人们很纠结，一个叫做tarsal—less的促进发育的果蝇身上的转录本以前认为它是非编码RNA基因，但是最近研究发现其能够编码产生一些短但是有功能的多肽，这个基因结构被认为是昆虫特有的[121，122]。最近，研究者在鼠胚胎干细胞中进行多核糖体断面图实验(ribosome．profilingexperiments)发现实际上大多数的长链非编码RNA都能够产生小的多肽[1231。这个现象不仅仅是发现了长链非编码RNA能够产生一些有功能的多肽片段，而且确切的了解到长链非编码RNA不是所谓的“转录噪音”，更重要的是让人们知道把一个转录本简单的一分为二，即它要么是编码蛋白基因，要么是非编码蛋白基因的观点是错误的，LL如SRA／SRAP就是一个多功能的基因，它既能够以非编码序列扮演调节者的角色，又能够以编码蛋白序列的形式合成蛋白质[124，1251。对这一现象的另一种解释认为这些短小转录本(ORFs)是整个翻译过程中的“基因样型(protogenes)”，通过过去许多年研究者们对多种群动物(包括灵长类)的一系列研究发现这些新发现的编码蛋白基因是先变成被转录的非编码序列，然后再进化成编码蛋白基因[126]。一项新的研究发现，经过多核糖体断面图实验评估，S．cerevisiae开放阅读框(OI江s)和低度保真序列(没有任何和已知基因102 博上学位论文综述类似的序列)虽然存在转录现象，但是不到四分之一表现出特异选择功能[127]。换句话说，这种现象可能在基因转录中广泛存在，许多编码蛋白基因并没有都在特异的条件下产生及编码蛋白，可能很多转录本并不具有生物功能然后在进化的过程中被逐渐淘汰，只剩下一些真正有生物学意义的基因。同样的道理也适用于非编码RNA基因，并不是所有的非编码RNA基因都具有生物学功能，基因组类似于一个巨大的蓄水池容纳所有的转录本，然后在进化过程中再挑选有意义的转录本保留下来[128】。上述一系列讨论让我们了解到现有对长链非编码RNA的起源、定位、功能及作用机制的一部分研究，在许多器官里面基因组中长链非编码RNA很大部分都被转录，但是几乎它们确切的功能和机制都是未知的。有些存在细胞核内，有些定位在细胞浆里；有些高表达，而有些则表达量低以至于很难检测到，用一种固定的标准模式去认识它们的特征，比如稳定性、保真度或者表达水平几乎是不可能的，也是毫无意义的。那些低度保守高度变异或者表达量较低的转录本有时候具有重要的功能，比如Kcnqlotl一般只有一个小时的衰变周期[129】；在X染色体失活中心位点的长链非编码RNA一般只存在于胚胎哺乳动物中且低度保守[130l；Repa则在每个细胞内只在表达5．10个复制体中表达[65】。同时，我们也要知道那些经过加工处理好能够和蛋白质反应的转录本也并不是都是必须的『53，131，132，133]。一方面，长链非编码RNA在进化中的低度保守序列和缺乏与疾病明确的相关性让人们认为其较少的参与生理活动，另一方面，随着高通量测序技术的发展成熟和生物信息学的不断进步越来越多的有关长链非编码RNA参与生物调节、参与疾病发生等证据被发现。将我们所有观察到的长链非编码RNA参与生命活动的现象放在一起，即使每一个都是很微小，这么巨大数量的长链非编码RNA的功能也是无法估量的。我们以前对长链非编码RNA的研究就是每当一条长链非编码RNA的转录被破坏时导致某一个明显的表型出现变化之后就会有人在某个实验中发现这个单个的长链非编码RNA。想要发现更多长链非编码RNA所扮演的顺式或者反式调节者角色，就需要有更精细的仪器发现更多的RNA和更全面的技术确认蛋白质、DNA和RNA三者之间的关联，特别是和长链非编码RNA的关系。当这些技术试验能够被广泛用在相当数量的种群身上时，这时候大量的功能长链非编码RNA才会浮出水面，可能会有一些物种特异性的 博士学位论文长链非编码RNA被一些新发明的实验所确认。我们此时必须要明白的是基因组的长链非编码RNA并不是一个已经自然进化到分类清楚功能明确的基因，而是可能处于一个混沌的状态[134，135】，我们期望当前的这一股对长链非编码RNA的研究热潮将来真的能够为我们解释目前有关长链非编码RNA的起源和功能的谜团，对生物基因组所蕴含的复杂意义有崭新的认识，对理解认识生物进化和人类疾病有重要的提示作用。 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塑主兰垡笙茎箜垄‘。’—————。。。。o。—’—————_·____-———’—-·___-·_____·___--________·_______——-—---_-——_—．___．-——，_-_-__-——_________-_-_____————————————————————一二[71GV．Fitzpatrick，P．D．Soloway,M．J．Higgins，Regionallossofimprintingandgrowthdeficiencyinmice砸thatargeteddeletionofKvDMRl．NatGenet32(2002)426．431．【72】D．Mancini—Dinardo，S．J．Steele，J．M．Levorse，eta1．，ElongationoftheKcnqlotltranscriptisrequiredforgenomicimprintingofneighboringgenes，GenesDev20(2006)1268—1282．[73】J．YShin，GV．Fitzpatrick，M．J．Higgins，TwodistinctmechanismsofsilencingbytheKvDMRlimprintingcontrolregion，EMBOJ27(2008)168-178．【74】ESleutels，R．Zwart，D．P．Barlow,Thenon—codingAirRNAisrequiredforsilencingautosomalimprintedgenes，Nature415(2002)810—813．【75】T．Nagano，J．A．Mitchell，L．A．Sanz,eta1．，TheAirnoncodingRNAepigeneticallysilencestranscriptionbytargetingG9atochromatin，Science322(2008)1717-1720．[76】K．Regha，M．A．Sloane，R．Huang，eta1．，Activeandrepressivechromatinareinterspersedwithoutspreadinginanimprintedgeneclusterinthemammaliangenome，MolCell27(2007)353·366．[77]T．B．Nesterova,B．C．Popova,B．S．Cobb，eta1．，DicerregulatesXistpromotermethylationinEScellsindirectlythroughtranscriptionalcontrolofDnmt3a，EpigeneticsChromatin1(2008)2．[78]YOgawa,B．K．Sun，J．T．Lee，IntersectionoftheRNAinterferenceandX—inactivationpathways，Science320(2008)1336-1341。【79】F．M．Pauler,M．v．Koemer,D．P．Barlow,SilencingbyimprintednoncodingRNAs：istranscriptiontheanswer?，TrendsGenet23(2007)284·292．[80】R．Terranova,S．Yokobayashi，M．B．Stadler,eta1．，PolycombgroupproteinsEzh2andRnf2directgenomiccontractionandimprintedrepressioninearlymouseembryos，DevCell15(2008)668—679．[81】J．L．Rinn，M．Kertesz，J．K．Wang，eta1．，FunctionaldemarcationofactiveandsilentchromatindomainsinhumanHOXlocibynoncodingRNAs，Cell129(2007)1311-1323．[82]M．Chotalia,S．A．Smallwood，N．Ruf,C．Dawson，eta1．，Transcriptionis111 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堕壁墅鲨一堡堕—————————’—————————————————————————-—●-___●__—-●--__-__—-———————————————————————————————一——⋯。。一【94】M．Szymanski，M．Z．Barciszewska,V．A．Erdmann，eta1．，Anewfrontierformolecularmedicine：noncodingRNAs，BiochimBiophysActa1756(2005)65．75．【95】D．Beysen，J．Raes，B．ELeroy,eta1．，Deletionsinvolvinglong．rangeconservednongenicsequencesupstreamanddownstreamofFOXL2asanoveldisease—causingmechanisminblepharophimosissyndrome，AmJHumGenet77(2005)205-218．[96]B．D’Haene，C．Attanasio，D．Beysen，eta1．，Disease．causing7．4kbcis‘regulatorydeletiondisruptingconservednon．codingsequencesandtheirinteractionwiththeFOXL2promotor：implicationsformutationscreening，PLoSGenet5(2009)e1000522．[97】M．A．Faghihi，F．Modarresi，A．M．Khalil，eta1．，ExpressionofanoncodingRNAiselevatedinAlzheimer'sdiseaseanddrivesrapidfeed—forwardregulationofbeta-secretase，NatMed14(2008)723-730．【98】E．Mus，ER．Hof,H．Tiedge，DendriticBC200RNAinagingandinAlzheimer’Sdisease，ProcNatlAcadSciUSA104(2007)10679-10684．[99】T．Gutschner,S．Diedefichs，Thehallmarksofcancer：alongnon．codingRNApointofview,RNABiol9(2012)703-719．[100】L．Hart，K．Zhang，Z．Shi，eta1．，LncRNAprofileofglioblastomarevealsthepotentialroleoflncRNAsincontributingtoglioblastomapathogenesis，IntJOncol40(2012)2004—2012．[101】EYang，L．Zhang，X．S．Huo，eta1．，Longnon-codingRNAhi曲expressedinhepatocellularcarcinoma(IncRNA—HEIH)facilitatestumorgrowththroughenhancerofzestehomolog2，Hepatology(20l1)．【102】A．C．Tahira，M．S．Kubrusly,M．F．Faria，eta1．，LongnoncodingintronicRNAsaredifferentiallyexpressedinprimaryandmetastaticpancreaticcancer,MolCancer10(2011)141．【103]J．R．Prensner,M．K．Iyer,O．A．Balbin，eta1．，TranscriptomesequencingacrossaprostatecancercohortidentifiesPCAT-1，anunannotatedlincRNAimplicatedindiseaseprogression，NatBiotechnol29(2011)742·749．11气 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博士学位论文综述androgenreceptoractivity,BiochemJ369(2003)163-171．[125】S．Chooniedass—Kothari，E．Emberley,M．K．Hamedani，eta1．，ThesteroidreceptorRNAactivatoristhefirstfunctionalRNAencodingaprotein，FEBSLett566(2004)43—47．[126]D．Tautz，T．Domazet·Loso，Theevolutionaryoriginoforphangenes，NatRevGenet12(20111692-702．[127]A．R．Carvunis，T．Rolland，I．Wapinski，eta1．，Proto—genesanddenovogenebirth，Nature487(2012)370—374．[128】J．T．Kung，D．Colognori，J．T．Lee，LongNoncodingRNAs：Past，Present，andFuture，Genetics193(2013)651-669．【129】M．B．Clark，R．L．Johnston，M．Inostroza-Ponta，eta1．，Genome一谢deanalysisoflongnoncodingRNAstability,GenomeRes22(2012)885—898．[130】L．S．Davidow,M．Breen，S．E．Duke，eta1．，ThesearchforamarsupialXICrevealsabreak谢mvertebratesynteny,ChromosomeRes15(2007)137-146．【13l】C．P．Ponting，T．GBelgard,Transcribeddarkmatter：meaningormyth?，HumMolGenet19(20lo)R162-168．[132】H．vailBakel，C．Nislow,B．J．Blencowe，eta1．，Most”darkmatter”transcriptsareassociated埘thknowngenes，PLoSBiol8(2010)e1000371．【133】P．Schorderet，D．Duboule，Structuralandfunctionaldifferencesinthelongnon-codingRNAhotairinmouseandhuman，PLoSGenet7(2011)e1002071．[134】M．Lynch，Theevolutionofgeneticnetworksbynon—adaptiveprocesses，NatRevGenet8(2007)803-813．[135】E．v．Koonin，Y．I．Wolf,Constraintsandplasticityingenomeandmolecular—phenomeevolution，NatRevGenet11(2010)487—498．116 博士学位论文攻读学位期间主要研究成果1。科研课题攻读学位期间主要研究成果参加国家自然科学基金面上项目“miR一125b．STAT3反馈调节环路参与骨肉瘤发生、发展的机制研究”的申报及研究工作2．论文发表情况(1)Jin—pingLi，Li—hongLiu，JieLi，YouChen，HuiLi，Xiao—weiJiang，Han—chonZhang，HuiZhong，YaoXiao木．ExpressionprofileoflongnoncodingRNAsinhumanosteosarcomareveMedbymicroarray．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications．433(2)，PP200—206，2013／4／5；(2)Liu，Li—hong，Li，Hui，Li，Jin—ping，Zhong，Hui，Zhang，Han-chon，Chen，Jia,Xiao，Tao*．miR一125bsuppressestheproliferationandmigrationofosteosarcomacellsthroughdown—regulationofSTAT3．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，416(1—2)，PP31—38，2011／12／9；(3)张催，陈游，张春雷，王万春，李金平．单髁置换术与全膝关节置换术治疗膝单问室骨性关节炎近中期疗效的对比研究中华关节外科杂志(电子版)，02期，2010117 博士学位论文致谢数载寒窗，转眼就要告一段落，在即将进行博士学位论文答辩之际，衷心感谢敬爱的导师肖涛教授对我的孜孜不倦的教导和培养。导师务实严谨的治学态度和科学思维，广博的学识造诣，精湛娴熟的专业技术，勇于创新、积极进取、不屈不挠的精神及崇高的敬业精神，为人师表的高尚品德，卓远的见识和宽广的胸襟，深深地感染和激励着我，在我今后的临床工作、学习和生活中必将终生收益，永远激励和鞭策我前进。肖老师是我终身学习的榜样。衷心感谢师母在学习和工作上无微不至的关怀和帮助。衷心感谢骨科孙材江教授、傅荫宇教授、李贺君教授、王万春教授、倪江东教授、陈游教授、张湘生教授、何爱咏教授、、彭丹教授、张庆教授、董忠根副教授、黄国良副教授、谢宏明副教授、毛新展副教授、陶澄副教授、黎志宏副教授、刘立宏主治医师、周政主治医师、陈滔主治医师、郭晓柠主治医师、宋德业主治医师、丁木亮主治医师、黄添隆主治医师、吴韧主治医师、刘傥主治医师、林凌医师、朱可为医师、樊天明护士长、戴宇护士长、肖霞护士长等老师及骨科全体护士老师在临床工作、课题标本收集及生活中给予的无私帮助和关怀。在进行课题实验中得到了医学中心实验室(方建珍老师、杨，it,洁老师、王剑老师、海志杰老师)、表观遗传实验室(王盛老师、李亚萍老师)、创伤骨科研究室老师(张薇老师、李桔元老师)的大力支持和帮助，在此表示衷心的感谢。感谢研究生管理中一it,陈亮辉老师，李玲老师和乐腊梅老师。特别感谢姚茂金博士，谭洁琼博士在课题过程中给予我的悉心指导。衷心感谢钟慧博士后、姜效韦博士、李辉博士、郭鸿彬博士、欧阳玉蓉博士、刁春雨博士、张晗狮博士、曹政博士、李安平硕士、卜洁硕士、杨一搏硕士、胡天鑫硕士、崔云鹤硕士、张琨硕士、龙义硕士、郑中慧硕士、蔡东良硕士、李晓阳硕士、何翔硕士、刘颖顾硕士等师兄弟妹对我学习、工作的大力帮助。衷心感谢在实验室和我一起奋斗的同学(秦莉峰博士、史雅静硕士、张晟硕士等)给予我的大力帮助，他们陪伴我度过愉快的时光。特别要感谢父母亲、妹妹、易纯子及我所有的家人和朋友对我学业的大力支持与鼓励，正是他们的巨大努力才能使我的学业得以顺利完成。在我完成学业之际，谨向所有帮助过我的老师、同学和朋友致以最深的感谢和崇高的敬意!
