脂肪酶固定化的新方法研究及其应用

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1、浙江大学化工系博士学位论文脂肪酶固定化的新方法研究及其应用姓名：杨光申请学位级别：博士专业：生物化工指导教师：杨立荣20090701摘要脂肪酶是一种水解酶，其突出特点是能够在油．水界面实施催化功能，被广泛应用于食品、医药及手性化合物合成等领域。由于固定化酶具有稳定性高、易回收和重复利用等优点，一直以来是酶工程的热点研究领域之一。本文以有机相中酶法拆分消旋烯丙醇酮为对象，以制备高活性、高稳定性和高对映体选择性的固定化脂肪酶催化剂为目标，从固定化载体材料和固定化方法两个方面研究固定化过程对酶催化性能的影响规律及作用机制，研究新型的脂肪酶固定化方法。主要内

2、容如下：(1)以廉价的天然无机材料硅藻土为载体，通过表面改性使之表面连接上不同的疏水性有机官能团，具体包括甲基丙烯酰氧基丙基、辛基、十二烷基、乙烯基等。采用吸附法对Arthrobactersp．脂肪酶(ASL)进行固定化，研究载体表面性质对固定化酶催化性能的影响。结果表明，经疏水表面改性的载体能明显影响固定化酶的蛋白结合量、活力和稳定性，但影响规律不同。其中，甲基丙烯酰氧基丙基载体所得固定化酶的活力最高，但稳定性相对较低，而十二烷基固定化酶的活力和稳定性均相对较高。以十二烷基修饰的硅藻土为载体，研究载体疏水性强弱、酶与载体比例以及缓冲液pH等因素对吸

3、附固定化酶性能的影响规律，并对固定化工艺进行优化，最终确定较佳的条件为：载体硅烷化程度O．089／g载体、酶与载体的比例1／30．1／40、缓冲液为pH9．0，0．03M的Hs．HCl。在吸附的基础上用戊二醛进一步处理，得到酶聚集体包被法固定化酶。该固定化酶的蛋白结合量、活力及稳定性等均较吸附法有明显提高，总活力回收达到游离酶的8．5倍；眨200；重复利用20天后，残余酶活力为原来的76％左右；(2)以氨丙基三甲氧硅烷和正硅酸乙酯(TEOS)为前体，采用溶胶凝胶法合成氨丙基凝胶，并用戊二醛对其进行活化使其末端带有游离的醛基。以该凝胶材料为载体分别采用

4、共价结合和酶聚集体包被两种方法对脂肪酶ASL进行固定化。结果表明，这两种方法所得固定化酶的稳定性明显升高。其中，基于共价结合的酶聚集体包被法固定化酶在蛋白结合量和酶活力等方面均比单纯的共价结合法要高，其总酶活回收为游离酶的84％；皮200；重复利用9次后，残余酶活在95％以上：III浙江大学博士学位论文(3)以非烷烃类的硅烷化试剂甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MAPTMS)和正硅酸乙酯(TEOS)为混合前体采用溶胶凝胶包埋法对脂肪酶ASL进行固定化，并将之与已报道的烷烃类硅烷前体所制备的包埋固定化酶进行比较。结果表明，该固定化酶在p-NPP水解以及

5、烯丙醇酮转酯化拆分两个反应体系中均表现出比其它前体更高的酶活力，并且这些固定化酶活力的高低与凝胶材料的疏水性强弱无直接对应关系；此外，在烯丙醇酮的转酯化反应体系中，固定化酶的对映体选择性明显升高。研究包埋条件对固定化酶催化性能的影响规律，并对包埋工艺进行优化，包括MAPTMS与TEOS的摩尔比，前体水解过程中水的添加量以及酶的添加量等，最终在较佳的条件下固定化酶的总活力回收为游离酶的13．6倍，蛋白负载量为1．4mg／g固定化酶；最佳固定化条件下所得的包埋酶表现出比游离酶更高的稳定性，在烯丙醇酮转酯化反应体系中，固定化酶重复利用60天后残余酶活力为原

6、来的54％左右；而游离酶重复利用20天后，残余酶活力为52％；(4)将溶胶凝胶包埋固定化酶用于烯丙醇酮转酯化拆分反应体系中，考察了反应温度、外扩散和内扩散效应、底物浓度和产物浓度等条件对酶活力、选择性以及反应过程的影响，结果表明上述反应条件的改变对酶的对映体选择性基本无影响；当摇床转速大于200r／min时可基本消除外扩散的影响；当固定化酶的粒径小于1．0mm时可基本消除内扩散限制；当底物浓度和产物浓度小于1．0mol／1时，酶催化过程无抑制现象存在。在无内外扩散及底物和产物抑制的前提下研究了溶胶凝胶包埋固定化酶催化转酯化反应拆分烯丙醇酮的动力学。根

7、据乒乓反应机制建立了动力学模型，反应速率方程为矿：匕【旦，其中，‰=1．00mmol／1／min，K一+KnA[B]+K月占[曰]+KoA[Q]+KBoA[B][Q]肠=1．80mmol／1，KAe=131．84，KBA=5．10，KQA=366．66，KsOA=0．521／mmol。此外，尝试了一种合成S．烯丙醇酮的新工艺，即以消旋烯丙基呋喃甲醇为起始原料，先经过生物拆分得到其S．对映体，然后采用化学重排的方法将S．烯丙基呋喃甲醇转化为S．烯丙醇酮。采用脂肪酶催化的转酯化反应对烯丙基呋喃甲醇进行动力学拆分，通过筛选催化剂和有机溶剂，优化反应条件，最

8、终建立了较佳的酶法转酯化拆分烯丙基呋喃甲醇的反应体系，即脂肪酶Rhizopusarrhizus为催化剂，烯丙