RPA在水产病毒病原检测中的应用及毛蚶疱疹病毒流行病调查.pdf

《RPA在水产病毒病原检测中的应用及毛蚶疱疹病毒流行病调查.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150150296上海海洋大学硕士学位论文RPA在水产病毒病原检测中的应用题目：及毛蚶疱疹病毒流行病调查ApplicationofRPAinthedetectionoftheaquacultureviralpathogens英文题目：andepidemicinvestigationofherpesvirusinScapharcasubcrenata专业：渔业研究方向：病原检测姓名：高芳指导教师：王江勇二O一八年五月十五日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术

2、道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、

3、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文RPA在水产病毒病原检测中的应用及毛蚶疱疹病毒流行病调查摘要鲍疱疹病毒（AbaloneHerpesVirus,AbHV），赤点石斑鱼神经坏死病毒（Redspottedgroupernervousnecrosisvirus,RGNNV）和牡蛎疱疹病毒（Ostreidherpesvirus1,OsHV-1）是对水产养殖动物危害较严重的3种病毒，目前没有有效的治疗方法。海水养殖病害防控“

4、以防为主”。国内外在水产疫病诊断技术方面，已经建立了各种常见水产疫病病原的检测方法，如PCR、qPCR、LAMP、抗原抗体检测、核酸杂交检测等。本研究针对上述3种病毒分别设计了合适的引物和探针，用荧光定量重组酶聚合酶扩增（QuantitativeRecombinasepolymeraseamplification,qRPA）的方法进行检测，通过与荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）比较来评估qRPA试验方法的灵敏度和特异性。结果显示：qRPA对AbHV检测的灵敏度为100拷贝，反应时间仅为20±0.50分钟；在对疑似感染AbHV的杂色鲍（Haliotisd

5、iversicolor）样品进行检测时，qRPA和qPCR对AbHV的检测率分别为96%和93%。qRPA对RGNNV检测的灵敏度为100拷贝，反应时间为20±0.50分钟；检测疑似感染RGNNV的石斑鱼（Epinephelussp）样品时，qRPAI上海海洋大学硕士学位论文和qPCR对RGNNV的检测率分别为97%和95%。在对OsHV-1进行检测时，以ORF95为模板设计的引物和探针可以检测到5拷贝的DNA，远高于本研究所采用的qPCR检测的灵敏度（100拷贝）；qRPA和qPCR检测疑似感染OsHV-1的毛蚶（Scapharcasubcrenata

6、）样品时，对OsHV-1的检测率都是22%。另外，利用qPPA和qPCR分别对感染三种病毒的样品进行验证时，检测结果之间均呈现出较好的相关性，R2均大于0.8。WhatmanFTA卡是一种可以在室温下对各种生物样品进行收集、运输、存档和核酸纯化的滤膜设备。本研究使用FTA卡提取感染RGNNV的石斑鱼脑组织中的RNA，运用RT-PCR方法成功检测出了RGNNV。这种提取方式大大简化了病毒提取的步骤，节约时间和成本。为了使检测结果可视化，本研究中还尝试了用RPA结合横向流动试纸条（Lateralflowdipstick,LFD）的方法检测AbHV、RGNNV

7、和OsHV-1，并验证该方法的灵敏度。3种病毒阳性质粒的反应时间为5min时，LFD对它们的检测限分别是10拷贝、10拷贝、100拷贝。本研究还利用qPCR方法检测了15个沿海城市的毛蚶样品中的OsHV-1感染情况，对毛蚶中OsHV-1的地域分布以及感染率的情况有了深入了解。流行病调查结果显示，除了深圳、大连、连云港和南通地区采集的毛蚶检测到OsHV-1外，其他地区均未检测到该病毒。关键词：鲍疱疹病毒，赤点石斑鱼神经坏死病毒，牡蛎疱疹病毒，II上海海洋大学硕士学位论文重组酶聚合酶扩增，FTA，横向流动试纸条，流行病调查III上海海洋大学硕士学位论文App

8、licationofRPAinthedetectionoftheaquacult