鸡mx基因的克隆、表达及其抗病活性的研究

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1、扬州大学硕士学位论文鸡Mx基因的克隆、表达及其抗病活性的研究姓名：倪黎纲申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：李碧春20080501扬州大学硕士学位论文扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者龇绵如签字日期：庐，。占年占月7矿日学位论文版权使用授权书吣本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校

2、有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文艏签名：知孔孑．寸导师躲签字日期：承口6髟年‘月／∥日签字日期：§私年倪黎纲：鸡Mx基因的克隆、表达及其抗病活性的研究鸡M×基因的克隆、表达及其抗病活性的研究研究生：倪黎纲导师：李碧春专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)中文摘

3、要Mx基因是Lindemn锄在研究A2G小鼠抗流感病毒试验时发现的，因能抵抗粘液病毒而命名为Mx(m)，)【ovirusresistallt)基因。关于禽类Mx蛋白的研究，1992年首次发现了鸭的Mx蛋白后，鸡的№蛋白基因也被克隆，鸡的Mx蛋白的抗病毒活性受63l位氨基酸的影响，当631位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性，为丝氨酸时则无抗病毒活性。但将鸡Mx蛋白用于提高鸡体免疫力的研究还鲜见报道，本研究拟探索通过对同种异体鸡MX基因进行改造构建鸡抗病毒重组基因、表达抗病毒蛋白的思路，旨意在从提高鸡自身抗病毒能力上应对禽类病毒病的威胁探索新思路。主要研究如下：1．以50pg／mLP01

4、y(I)·P01y(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达，7小时后提取细胞总I斟A，根据发表文献设计一对扩增全长№cDNA特异性引物，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出全长MxcDNA，扩增产物克隆入pMDl9．TSinlple载体中进行序列测定。结果：与Ge出ank发表的鸡MxcDNA序列AB088535、Ay695797、NM204609、XM429240、Z23168的同源性分别为99．6％、99．5％、99．4％、99．7％、99．4％，说明所扩增的序列为本实验所要的。获得的鸡MxcDNA序列在2032位碱基为G，该基因的抗病毒活性还需做进一步研究。2．采用简单易

5、行的大引物PCR突变技术将鸡Mx基因的全长cDNA第2032位的碱基由G突变为A(既631位氨基酸的改变)，并将突变的Mx基因插入真核表达载体pcDNA3．O，重组表达载体经PCR、酶切鉴定验证构建正确后，提取并纯化重组质粒。采用脂质体法转染COS．I细胞，ImPCR与间接免疫荧光(IFA)鉴定其表达。然后提取并纯化转染Mx基因的COS．I细胞裂解液，采用NDV—扬州大学硕士学位论文2CEF微量细胞抑制试验，迸一步确定Mx蛋白的抗病毒活性。结果：对鸡Mx基因进行PCR诱变修饰正确，构建了能够正确表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体。微量细胞抑制试验分析结果显示，重组Mx蛋白具有较强的抗

6、新城疫病毒生物活性。3．以酶切线性化的重组质粒为目的基因，直接将目的基因通过随机打点法注射入睾丸，转染SSCs，产生携带有目的基因的成熟精子用于生产转基因鸡。采用常规PCR检测技术，在DNA分子水平检测证实外源基因(Mx)的整合。结果：PCR检测证实外源基因(№)已整合到精子基因组，且能通过体外受精在后代中稳定整合，后代PCR检测的阳性率为27．27％(耽2)。表明睾丸内注射法可能是一种切实可行、简单并利于推广的制备大群转基因鸡的方法。关于重组Mx蛋白的其它抗病毒活性与抗病转基因鸡实验正在研究之中。关键词：鸡；Mx蛋白；PCR突变；抗病毒活性；精原干细胞；转基因鸡倪黎纲：鸡Mx基因

7、的克隆、表达及其抗病活性的研究3CloningandExDressionofMxGene仔omChickenandClOnlngandEXDreSSlOnOtJVⅨUeneirOm乙n1CkenandIdentmcationofitsantiViralspecific时M．S．Candidate：NiLigangAdvisor：Prof．LiBicb珊M旬or：Animalgenetics，breedingandr印roduction(CollegeofAnimalS