不同外植体和激素对银杏愈伤组织诱导和生长的影响

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1、2008年3月山东师范大学学报(自然科学版)Mar.2008第23卷第1期JournalofShandongNormalUniversity(NaturalScience)Vol.23No.1不同外植体和激素对银杏3愈伤组织诱导和生长的影响1)331)2)1)杜希华孙秀玲郝岗平侯福林(1)山东师范大学生命科学学院,250014,济南;2)泰山医学院生物技术教研室,271000,山东泰安∥第一作者42岁,男,副教授)摘要以银杏胚的不同部位子叶、胚芽、胚轴、胚根为外植体,比较不同外源激素和培养条件对银杏愈伤组织诱导和继代培养的影响,结果表明子叶最易诱导愈伤组织,且在暗条件下诱导效果最好,2,4-

2、D和BA影响子叶的愈伤诱导能力;以茎段为外植体,发现生长素为茎段愈伤组织诱导所必需,且NAA诱导效果好于2,4-D;以叶片为外植体,发现生长素中的NAA诱导愈伤效果最好,雌雄叶的诱导能力相同.在愈伤组织生长过程中,NAA是子叶和茎段愈伤组织继代培养必需的,BA对茎段愈伤组织生长速度无显著影响,但可使愈伤组织致密,并有利于分化.MS+1mgPLNAA+0.005mgPLKT(或BA)的培养基对叶片愈伤组织生长最理想,雄叶愈伤生长较快,光照培养促进愈伤组织生长.关键词银杏;外植体;激素;愈伤组织诱导;继代培养中图分类号Q949.64银杏(GinkgobilobaL.)是现存种子植物中最古老的孑遗

3、植物,是源于我国的特有珍贵树种.其叶中所含的银杏黄酮和银[1]杏内酯、白果内酯等成分,在临床上被用作治疗多种疾病的特效药物.目前医用银杏黄酮类和内酯类药物仍依靠从银杏叶提取,但由于含量低,需消耗大量的银杏叶源,而且采叶影响树体生长和种实产量.因此利用植物组织和细胞培养技术生产银[2]杏黄酮和内酯类化合物并探讨有效提高培养细胞中有效药用成分的产量,解决银杏生产和应用开发中所面临的困难具有[3,4]积极的现实意义.近年来,虽然有一些关于银杏愈伤组织培养的研究报道,但均缺乏系统性.本实验室经过多年的实验,系统研究了外植体类型、性别、生理状态、培养基激素配比及培养条件等因素对银杏愈伤组织诱导和生长的

4、影响,为探讨愈伤组织生长与银杏黄酮和内酯类合成之间的相互关系打下了基础,并可为进一步的工业化生产提供实验依据.1材料与方法1.1材料银杏种子购自山东省郯城县银杏生产基地.银杏茎段和叶片采自山东师大校园内的成树(树龄约55年,按雌雄树定株采集).1.2外植体消毒、接种和培养1.2.1胚不同区段剥去种子的骨质中种皮,在75%乙醇中浸泡15s,再用0.1%HgCl2灭菌8min,无菌水冲洗4～5次,于无菌条件下剥离胚,接种于不含激素的MS培养基上使其萌发,5d后切取萌发胚的不同区段,分别将子叶、胚芽、胚轴、胚根接种于诱导培养基上,培养.1.2.2茎段和叶片从雌、雄株上剪取生长旺盛的当年生枝条,将幼

5、嫩枝梢和叶片分开,流水冲洗后,灭菌(方法同上),在超净工作台上将茎段切成0.8～1.0cm的小段(不带腋芽),叶片切成0.5cm×1.0cm的小块,分别接种于诱导培养基中.1.3愈伤组织的继代培养培养30d左右,将诱导形成的愈伤组织转入适宜的继代培养基中,进行扩大培养.-2-11.4培养条件光照处理时,照度为27μmol·m·s,每天光照12h.黑暗处理时,完全不照光.光、暗处理的温度均为(25±2)℃.1.5培养基均采用MS基本培养基.根据不同的外植体类型,选择不同的激素配比组合成各种固体培养基.各培养基均含3%蔗糖,pH约6.0.1.6愈伤组织生长量的测定在培养过程中,定时将愈伤组织从培

6、养瓶中取出(注意:尽可能不带培养基),用电子天平称其鲜重,100℃杀青后转入80℃烤至恒重,再称其干重.以愈伤组织鲜(干)重的增长量(5瓶的平均数)表示愈伤组织生长情况.2实验结果2.1愈伤组织的诱导2.1.1成熟胚愈伤组织的诱导1)胚的不同部位愈伤组织发生率的差异将伸长胚的子叶、胚芽、胚轴、胚根分别接种在16种诱导培养基上(培养基组成见表1),光下培养5～12d,胚轴、子叶和胚芽均可诱导出现愈伤组织,诱导率最高可达100%;而胚根只有在较高浓度的2,4-D(2mgPL、4mgPL)作用下,才能诱导产生少量愈伤组织.以胚轴为外植体,愈伤组织诱导效果好于子叶,但由于银杏的胚轴非常短,数量有限,

7、所以我们主要用子叶为外植体研究胚愈伤组织的诱导情况.3山东省科技厅计划项目资助(971164601和94031001);33通讯作者收稿日期:2007-09-20129第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第1期2)光、暗条件对子叶愈伤组织诱导的影响将子叶接种在各种诱导培养基上,分别置于光照和黑暗条件下培养(表1).实验表明暗培养条件下,愈伤组织发生比光培养条件下提早,诱导率也增高,尤其在低浓度2,4-D(0