苹果受体样激酶基因MdLYK1克隆及功能分析

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1、分类号密级UDC单位代码硕士学位论文苹果受体样激酶基因MdLYK1克隆及功能分析IdentificationandFunctionAnalysisofaLysinMotif-TypeReceptor-LikeKinaseGenefromApple(Malus×domestica)研究生姓名陈启明指导教师柏素花副教授学科专业生物化学与分子生物学研究方向果树抗病分子生物学中国.青岛二〇一八年六月IdentificationandFunctionAnalysisofaLysinMotif-TypeReceptor-LikeKinaseGe

2、nefromApple(Malus×domestica)ThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceChenQiming（CollegeofLifeScience）Supervisor:BaiSuhuaQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，

3、论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：

4、时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论文摘要苹果受体样激酶基因MdLYK1克隆及功能分析摘要苹果是我国栽培面积较为广泛的果树品种，是果农的重要经济来源之一。而苹果轮纹病(Botryosphaeriadothidea)是我国苹果三大真菌病害之一，为了降低果农损失，迫切的需要一种有效的方法来控制该病的发生与传播。探索苹果对轮纹病的防御机制，对选育抗病苹果品种具有重要的意义。模式识别受体（PRRs）是一个很大的蛋白家族，它们参与到植物细胞对病原的识别过程，但是对于它们在苹果植株中具体的识别机制，目前了解得并不清楚。通过对

5、侵染轮纹病前后的差异表达基因进行转录组分析，发现了一个在苹果轮纹病菌诱导下高表达的潜在PRR编码基因，并命名为MdLYK1。本试验以‘富士’（‘Fuji’）枝皮为材料，克隆得到了该基因，并对其进行生物信息学分析；利用QRT-PCR技术检测MdLYK1基因对病原侵染的响应情况；通过融合表达GFP并瞬时转化本生烟草叶片，研究其亚细胞定位情况；通过体外表达MdLYK1胞外域，研究其配体结合特性；通过转化本生烟草并进行病原菌侵染处理，进一步研究MdLYK1的功能。研究结果如下：1、以‘富士’一年生新枝表皮为材料，克隆目的基因，将其命名为Md

6、LYK1。其开放阅读框长度为1827bp，编码609个氨基酸，推测的蛋白质分子量为72.64kD，等电点（pI）为5.89。对MdLYK1蛋白进行了氨基酸序列分析、三维结构分析以及系统进化分析，结果显示MdLYK1蛋白由含3个LysM结构的胞外域、胞内激酶区及跨膜区组成，定位在质膜，胞外域可结合几丁质。2、构建pCAMBIA1300-221-HA-MdLYK1-GFP载体并转化农杆菌，利用渗入法将GFP融合蛋白在烟草叶片中瞬时表达，亚细胞定位试验证明了MdLYK1蛋白定位在细胞膜上；构建pET28-MdLYK1-ECD载体并转化E.

7、coliBL21（DE3），通过IPTG诱导MdLYK1-ECD表达，纯化后进行配体结合试验，结果证明MdLYK1-ECD可在体外直接结合几丁质而不与肽聚糖结合。3、MdLYK1基因在‘富士’苹果植株中受真菌病原轮纹病菌、炭疽病菌诱导而显著上调表达，但不受细菌病原火疫病菌的诱导，说明MdLYK1的表达与苹果植株对真菌病害的防御反应有关。4、MdLYK1在结构和配体结合特性上与AtCERK1相似，但其在本生烟草叶片中瞬时表达不能诱导细胞死亡，与AtCERK1不同，说明苹果与拟南芥中的真菌防御机制不1青岛农业大学硕士学位论文摘要同。5、

8、利用农杆菌介导法在本生烟草中过表达MdLYK1，通过PCR、WesternBlot筛选获得了阳性转基因株系。病原侵染试验表明，转基因烟草植株对所用真菌及细菌病原的抗病性明显增强，这种增强的抗病性与转基因植株中更高的ROS和胼胝质的积累