小鼠脊髓损伤后rhoa表达的时空变化

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文小鼠脊髓损伤后RhoA表达的时空变化TemporalandspatialpatternofRhoAexpressiononthe"iuredDinalwd。’micemlUreasDlnalCOrOlmIce课题来源：国家自然科学基金学位申请人导师姓名康晓宁郭家松教授专业名称人体解剖与组织胚胎学培养类型培养层次所在学院学术型硕士研究生基础医学院2013年04月25日广州硕士学位论文一一一一一一＼煳㈣小鼠脊髓损伤后RhoA表达的时空变化硕士研究生：康晓宁硕士生导师：郭家松教授摘要目前的

2、研究结果表明，脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)后，在其损伤区域开始出现大量不同的轴突生长抑制物质，这些生长抑制物质大致可分为3类：髓磷脂相关抑制物(myelin．associatedinhibitor，MAI)、胶质瘢痕起源的抑制物(inhibitorycomponentsoftheglialscar，ICGS)、斥性轴突导向分子(repulsiveaxonguidancemolecules，RGM)。据报道阻断这些抑制因子将会提高SCI后神经修复效果。越来越多的研究认为，中枢神经损伤后神经元t为

3、RhoA的表达及其活化是轴突再生能力低下的主要内因，神经损伤处微环境内的大部分抑制剂分子可以刺激和激活神经元内的RhoA及进一步激活其下游信号通路来抑制神经轴突的生长。由此可见，RhoA在脊髓损伤病理学和再生修复中起着极其重要的作用。RhoA蛋白是一种小分子GTPase，属于Ras超家族中的一员，能结合GDP(无活性)或GTP(有活性)，从而发挥其主要的分子开关作用，是所有真核细胞细胞骨架肌动蛋白的调节因子。在哺乳动物神经系统的发育阶段，RhoA表达并参与调节神经元的迁移和突起的伸长，而在成熟神经元中几乎不表达。当神

4、经元损伤后，RhoA表达开始升高，并且能被激活。脊髓损伤后RhoA的重新高表达及其激活可致使轴突生长锥的塌陷。RhoA的高表达和激活还可以引起神经元和胶质细胞凋亡。因此，设法降低受损神经元的RhoA表达或抑制其激活就有可能为促进脊髓损伤修复提供一个新的治疗策略。目前关于脊髓损伤后RhoA的表达变化已有过一些报道，但是存在不同的观点：大部分报道认为损伤脊髓I为RhoA表达增加，但是也有人认为脊髓损伤并不摘要会改变RhoA的表达总量。另外，目前关于RhoA在损伤脊髓内表达变化的研究主要只关注了SCI急性或亚急性期的变化情

5、况。到目前为止，具体至lJRhoA在脊髓损伤后不同时间段、不同部位及不同细胞内的表达变化情况还不清楚。为了探明RhoA在损伤脊髓内的时空表达变化情况，本课题以成年小鼠全横断性脊髓损伤为动物模型，SCI术后存活l，3，7，14，28，56，112天后取材检测了RhoA阳性细胞的分布；RhoA阳性反应物在神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的定位：各种类型细胞中RhoA阳性免疫反应物的荧光强度的变化。为探讨RhoA在脊髓损伤病理变化过程的机制以及今后以RhoA为靶向治疗脊髓损伤提供基础。1．材料与方法1．1脊髓损伤模型的建

6、立昆明小鼠64只，雌性，12周龄，25"---'359。实验动物被随机分为假手术组和实验组：正常组(n-8)，实验组：术后存活1天、3天、7天、14天、28天、56天和112天(每个时间点n=8)。昆明小鼠称重后，用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为30mg／kg。正常组在麻醉后于小鼠背侧T10．11位置打开锥板，仅仅暴露脊髓。其他各组则需要在暴露同一位置脊髓后进一步用显微手术剪剪开硬脊膜，于T11位置垂直切除长度为lmm的一段脊髓，完全掏空损伤腔。实验组分别在切除脊髓，查无出血后逐层缝合。常规护理，注射抗生素2周，

7、每天早晚各一次排尿，持续1周。密切观察小鼠的身体和精神状态。1．2组织准备和双荧光免疫组织化学注射1％戊巴比妥钠麻醉，剂量为50mg／kg，用4％多聚甲醛灌注取材，后固定于4。C的4％多聚甲醛过夜。然后移入30％蔗糖溶液中过夜，用OTC包埋后作冰冻切片，用CMl900恒温箱冰冻切片机切片，切片方向分别为脊髓横切和脊髓纵切。横切组织取T9节段和T10节段分别被连续切片，121am厚。纵切组织取以损伤区为中心长约1．5厘米的脊髓组织，20p．m厚，连续切片。最后将所有的切片贴在涂有明胶防脱的载玻片上，储存在．20。C，以

8、备进一步使用。1．3免疫组化II硕士学位论文用抗体RhoA／NF200，RhoA／GFAP，RhoA／CNPase或RhoA／IBAl将组织切片行免疫组化双染来检钡lRhoA，以及RhoA阳性反应物在神经元、星形细胞、胶质细胞和小胶质细胞内的表达定位。为了阐明脊髓损伤后R_hoA在不同的实质细胞的时间和空间的详细表达变化情况，我们先后对T10段