新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

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1、万方数据第40卷第7期2009年7月东北农业大学学报JournalofNortheastA—culturalUniversity40(7)：55-59July2009新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证宋庆凤，暴立娟，李杰’(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030)摘要：巴斯德毕赤酵母(P／ch／apastor／s)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达栽体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子一GAP启动子替换毕赤酵母表达栽体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX

2、，成功构建了毕赤酵母组成型表达栽体pGAPHa。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换栽体上原有的a—Factor信号肽，结果表明，INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。关键词：毕赤酵母；表达裁体；GAP启动子；INU信号肽中图分类号：文献标识码：A文章编号：1005—9369(2009)07-0055-05ConstructionandprobationofneotypesecretingexpressionvectorsforPichia

3、pastoris／SONGQingfeng，BAOLijuan，LIJie(CollegeofLifeSciences，NortheastAgricul—turalUniversity，Harbin150030，China)Abstract：Pichiapastorisisoneoftheforeignproteinexpressionsystemwhichhasbeenwidelyused．TheexpressionvectorsforPichiapastodsarevaried，buttheycannotbeusedinfoodvocation，becauseoftheneedo

4、fmethanolinexpressionandtheleading-inofantibioticgenebytransformation．ThisresearchdesignedtoreplacethemethanolinducedAOXpromoterbyPichiapastori#sconstitutionalpromoter．GAPpromoter，andsuccessfullyconstructedthesecretingexpressionvectorpGAPHaforPichiapastoris．Thegeneencodingend争争1。4-xylanasefromT

5、dchodermaReeseLandxyn2genewereusedasareportergene，andthenthefunctionprobationindicatedthatthexyn2genecouldbeoverexpressedinPichiapastoris．BasedonthisneotypesecretingexpressionvectorpGAPHaⅡ．wereplacedthea-Factorbyinulasegene'ssignalpeptidesequencewhichhadbeenoptimizedincodon．theresultsshowedthat

6、theshowedgene。ssignalpeptidecouldalsoutilityguidethesecretingexpressionofxyn2gene．Keywords：Pichiapastoris；expressionvector；GAPpromoter；INUsignalpeptide随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母(Methylotrophicyeast)一毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有

7、效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达【l】。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[21。然而，虽然用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却难于适用食品蛋白的表达及工业生产要求。主要影响因素有两点：pHIL、pPIC系列表达载体由于收稿日期：2009-03—11基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设(KT05A400-1)作者