冷应激大鼠血浆差异表达蛋白的筛选与鉴定

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1、Universitycode：10223Classifiedcode：S852.21Graduatenumber：XS1233078Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationScreenandidentifydifferentiallyexpressedproteinsofplasmaincoldstressedratsPostgraduate：LiuYan-zhiSupervisor：Prof.YangHuan-minMaj

2、or：BasicveterinaryscienceResearchdirection：StressPhysiologyScienceCollegeofAnimalScienceCollege：＆VeterinaryMedicineDaqingChinaJune,2015摘要冷刺激作为寒区畜牧生产中常见的应激原，易引起动物处于冷应激状态，从而导致畜产品质量降低，动物死亡率增加，已成为制约我国养殖业快速发展的关键因素之一。冷应激发生机制的研究受到国内外科研工作者的广泛关注。目前，对冷应激发生机制的研究，往往只强调单个或少数几个分子在应激中的作用，缺

3、乏从整体水平的系统性研究，从而难以准确地评估动物是否真正处于应激状态。因此，本研究采用同重同位素相对与绝对定量（iTRAQ）结合质谱技术筛选冷应激大鼠血浆中的差异表达蛋白，以期在分子水平上寻找合适的冷应激诊断标志物，为冷应激的防治提供理论依据。本试验采用12周龄、体重（340±20）g的健康SPF级雄性Wistar大鼠作为研究对象。将试验鼠随机分为常温饲养组（Z组）和冷刺激组（L组）。常温饲养温度为（24.0±0.1）℃，冷刺激温度为（4.0±0.1）℃，冷刺激时间为12h。冷刺激后，采用ELISA、WesternBlot和荧光定量PCR方法分

4、别检测血清中IL-2与IL-4、外周血淋巴细胞中HSP70和mRNA表达水平的变化，来判断大鼠是否处于冷应激状态，从而确定冷应激大鼠模型建立成功。根据冷应激大鼠模型构建的条件，开始正式冷刺激试验。冷刺激后，采取大鼠血浆，采用iTRAQ技术筛选冷应激大鼠血浆中的差异表达蛋白，通过COG注释、GO和Pathway富集分析方法，找出与冷应激反应密切相关的差异表达蛋白；并经WesternBlot对其验证。结果如下：1.大鼠冷应激模型的建立与Z组相比，L组的大鼠血清中IL-2的含量显著升高（P<0.05），IL-4含量极显著升高（P＜0.01）；外周血淋

5、巴细胞内HSP70及其mRNA表达量水平显著升高（P<0.05）。同时，结合本课题组成员的检测结果：冷应激大鼠血清中IL-6、TNF-α和CORT的含量极显著升高（P＜0.01）、ACTH的含量显著升高（P<0.05）、IL-10无显著变化。综合表明，大鼠的冷应激模型被成功构建。2.应用iTRAQ技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白共筛出39个差异表达蛋白，其中29个差异表达上调蛋白，10个差异表达下调蛋白。经对差异表达蛋白的生物信息学分析，推测Ras相关蛋白Rap1b（Rap1b）和整合蛋白β-1（ITGB）与冷应激反应密切相关。3.差异表达蛋

6、白Rap1b和ITGB的WesternBlot验证与Z组相比，L组的Rap1b相对表达水平呈显著升高（P<0.05）；而ITGB相对表达I水平呈极显著升高（P<0.01）。结论如下：本试验成功构建了大鼠冷应激模型；应用iTRAQ技术成功筛选出冷应激大鼠血浆中的差异表达蛋白，经过生物信息学分析后，找出了与大鼠冷应激反应密切相关的差异表达蛋白Rap1b和ITGB；经WesternBlot验证，Rap1b和ITGB结果均为阳性，与iTRAQ技术检测结果相一致。关键词：冷应激，大鼠，iTRAQ，差异表达蛋白IIAbstractColdstimulati

7、onasacommoncoldstressorinlivestockproduction,easycauseanimalsincoldstresscondition,resultinginreducedqualityofanimalproductsandincreasedanimalmortality.Ithasbecomeoneofthekeyfactorstorestricttherapiddevelopmentofbreedingindustryinourcountry.Theresearchersalsopayattentiontost

8、udythemechanismofcoldstressbothathomeandabroad.Atpresent,thestudyofmechanis