副猪嗜血杆菌wza基因缺失株的构建及生物学特性研究

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1、＋２；Ｓ呂５５．１单位巧码０３６４分类号；１：．１２４密级：学号：巧的８签傲卷！Ｃｒ乂參学位论文副猪嗜血杆菌修３基因缺失株的构建及生物学特性硏究ｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ—ＣｏｎｄＣｈａｒａｃＷｚａｄｅｆｉｅｄ罚ｔＭｉｓｔａ打ｔｏｆＨａｅｍｏｐｈＵｕｓａｒａｓｕｉｓｐ研究生：康磊一指导教师：王成研究员合作指导教如和孙裴副教稷申请学位口类级别：农学硕古专业名称：预防兽医学研究方向：家畜传染病学－所在学院：动物科技学院笞辩委员会主席：＃

2、２０１５年６月AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateConstructionandCharacterizationofWza-deficeintMutantofHaemophilusparasuisCandidate:KangLeiSupervisor:Researcher.WangYiChenCooperationadviser:AssociateProf.SunPeiAcademicDegreeAppliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:Preventiv

3、eVeterinaryMedicineResearchfield:EpizootiologyCollege:AnimalScienceandTechnologycollegeJun,2015独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加封标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得安徴农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研巧生签名：时间：文口／ｆ年＾月曰关于

4、论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学校有奴保留送交抢义的复印件和磁盘，允许论文披查阅和借阅，可采巧影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。＇（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）－＾研究生签名：时间。：２八年月分日户－第一导师签名：处时间：５年本＞／（＾月摘要副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPs）是猪体内的条件性致病菌，毒力菌株可引起猪以纤维素性渗出为主的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。荚膜

5、一直被认为是HPs的一种重要毒力因子，荚膜多糖运输蛋白基因Wza在HPs中已被鉴定出来，但目前对HPs的Wza基因研究并不深入，其功能以及与其他相关基因的关系还未被阐明。为了研究HPs的Wza基因与荚膜形成的关系以及对荚膜毒力的影响，本课题试验构建了Wza基因缺失株，通过生长速率，菌体形态，抗吞噬试验，小鼠毒力试验，血清抗性试验以及药敏试验等生物学特性方面对比了野毒株与Wza基因缺失株之间的差异性，来探究Wza基因，HPs荚膜的形成以及HPs毒力变化的关系。主要试验成果如下：以ZJ1208菌株和pET-28质粒为基因模板，pUC-18质粒为载体，通过重叠PCR法构建同源重

6、组质粒pUC18-LR-Kan；再通过自然转化法，将pUC18-LR-Kan分别转化5个HPs菌株中，通过PCR和测序鉴定，最终成功获得了Wza缺失的HPs菌株ZJ1208-△Wza。Wza基因缺失和野毒株在菌落形态上没有明显差别；但ZJ1208野毒株的生长速率和活菌数浓度均高于ZJ1208-△Wza缺失株，在约培养12h时两者OD600都达到最大值，其分别为2.196和1.246；二者活菌数在约8h达到最大，其活菌数对数值分别为9.7634和9.3222。另外荚膜染色表明，ZJ1208-△Wza缺失株和ZJ1208野毒株都可形成较薄的荚膜层，但ZJ1208-△Wza缺失

7、株可形成长链状菌体和长杆状菌体，而ZJ1208野毒株则不能；沉降试验中，ZJ1208-△Wza缺失株菌液在静置2h即可出现肉眼可辨的菌体沉淀，而ZJ1208野毒株菌液在整个实验过程中不出现沉淀现象。对抗生素的敏感性试验中，Wza基因的缺失使菌体对β-内酰胺类相较ZJ1208野毒株表现出了更高的敏感性。细胞吞噬试验、小鼠攻毒试验和抗血清杀伤试验分别进一步说明了Wza基因的缺失能够减弱菌体抵抗细胞的吞噬和血清的杀伤作用，以及减弱对小鼠的侵袭性和致死性。关键词自然转化;Wza缺失株;荚膜;抗吞噬作用;致病性IAbstractHaem