海岛棉抗黄萎病相关基因gblox和gbaos的克隆与功能鉴定

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文海岛棉丨几黄委病相关基因和GMOS的克隆与功能鉴定学位申请人：张晓伟指导教师：马峙英教授李志坤副教授学科专业：作物遗传育种学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十三日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用

2、过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:签字FI期：年/月

3、闩学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字FI期：>/^年/

4、月丨日签字曰期：.yvlt年（月/R学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话:通讯地址：邮编:分类号：S562.035单位代码：10086密级：公开学号：2012209海岛棉抗黄萎病相关基因GbLOX和GbAOS的克隆与功能鉴定CloningandFunctionalCharacterizationofGbLOXandGbAOSinGossypiumbarbadenseDefenseinResponsetoVerticilliumdahliae学位申请人：张晓伟指导教师：马峙英教授李志坤副教授学科专业：

5、作物遗传育种学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十三日摘要棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传维管束病害，严重影响棉花的产量和纤维品质，因此抗黄萎病机制研究是棉花种质创新所要解决的关键问题之一。前人已报导LOX和AOS参与了植物的抗病反应，本研究以课题组构建的黄萎病菌胁迫下海岛棉Pima90-53根组织全长cDNA文库为基础，筛选得到11个LOX和AOS的EST序列。通过同源克隆和RT-PCR技术克隆得到了其对应的基因，分别命名为Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAOS

6、1和GbAOS2。主要研究内容包括：基因克隆和生物信息学分析，启动子克隆与调控序列分析，黄萎病诱导和外源激素处理下的基因表达分析，以及利用病毒诱导的基因沉默（Virus-inducedgenesilencing）鉴定基因抗黄萎病功能。本研究主要获得以下结果：1.通过同源克隆和RT-PCR技术，从海岛棉克隆获得2个编码脂氧合酶的基因—Gb9-LOX和Gb13-LOX，以及2个编码丙二烯氧化物合酶的基因—GbAOS1和GbAOS2，它们的ORF分别为2598bp、2616bp、1491bp、1572bp。

7、2.生物信息学分析表明，Gb9-LOX和Gb13-LOX都含有PLAT_LH2和Lipoxygenase活性位点，但Gb9-LOX编码蛋白为9-脂氧合酶，而Gb13-LOX编码蛋白为13-脂氧合酶；GbAOS1和GbAOS2都含有PLN02648活性位点，属于P450家族成员；这4个基因编码蛋白均预测为可溶性蛋白，且无跨膜域和信号肽。3.从海岛棉Pima90-53中克隆得到Gb9-LOX和GbAOS1的启动子，长度分别为1067bp和1212bp。生物信息学分析表明，Gb9-LOX的启动子中含有响应生

8、长素、乙烯、水杨酸、防御反应和类黄酮合成相关的MYB结合位点的顺式作用元件；GbAOS1的启动子中含有响应茉莉酸、水杨酸、乙烯、赤霉素、机械创伤、干旱和参与植物防御反应的顺式作用元件。4.利用qRT-PCR技术分析黄萎病诱导下和外源激素处理下基因的表达差异，发现Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAOS1、GbAOS2均能受黄萎病菌和茉莉酸甲酯诱导上调表达；Gb13-LOX、GbAOS1可受水杨酸诱导上调表达，而Gb13-LOX、GbAOS1的表达量不受乙烯的影响，Gb9-LOX、GbAOS2可受水

9、杨酸和乙烯诱导下调表达。5.组织特异性表达分析显示，Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAOS1、GbAOS2在根、茎和叶中均有表达，但Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAOS1在根中表达量最高，GbAOS2在茎中表达量最高。6.构建了这4个基因的VIGS沉默载体，并分析了沉默植株的黄萎病抗性，结果表明Gb9-LOX和GbAOS1的沉默显著降低了棉株对黄萎病的抗性，而Gb13-LOX和GbAOS2的沉默对棉株黄萎病抗性影响不显著。关键词：海岛棉；黄