人水离子通道蛋白4的表达及在视神经脊髓炎诊断中的应用

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1、学校代码10459学号或申请号2Q1212262&15密级公开郅州k%硕士学位论文人水离子通道蛋白4的表达及在视神经脊號炎诊断中的应用作者姓名：张迎娜导师姓名：潘卫东S1]教授学科门类:医学专业名称：免疫学培养院系：基础医学院成时2015年5月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheExpressionofHumanAquaporin-4andItsApplicationintheDiagnosisofNeuromyelitisOpticaByYingnaZ

2、hangSupervisor:WeidongPanImmunologyTheBasicMedicalCollegeofZhengzhouUniversityMay,2015学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宂作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年。月“日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，

3、知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：《乂^丫曰期：讀年公月么曰人水离子通道蛋白4的表达及在视神经脊髓炎诊断中的应用研究生张迎娜导师潘卫东副教授郑州大学基础医学院河

4、南郑州450001摘要背景视神经脊髓炎（neuromyelitisoptica,NMO）是中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)的严重性脱髓鞘疾病，主要损伤视神经和脊髓，多起病急骤且进展迅速，严重危害人类的健康。自1894年NMO这一概念被提出以来，对于NMO是一独立的疾病还是多发性硬化(mutiplesclerosis,MS)的亚型一直存在较大的争议。2004年Lennon等发现抗水离子通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)抗体是NMO的特异性致病抗体，从而证明了NMO是不同于MS的一种体液免疫介导的

5、自身免疫性疾病。由于NMO和MS的治疗和预后存在较大的差异，因此，检测疑似病例血清中的抗AQP4抗体水平对于NMO和MS的鉴别诊断、治疗及预后判断具有明显的指导意义。迄今为止国内尚缺乏灵敏度高和特异性强的试剂盒用于检测AQP4抗体，建立一种适用于国人NMO中自身抗体的检测方法是非常有必要的。目前已经证明该抗体的主要结合位点是其靶抗原AQP4的胞外区，克隆表达AQP4的胞外区有望为抗AQP4抗体的检测提供原料。另外通过真核表达系统表达AQP4全长蛋白，比较原核表达胞外区蛋白和真核表达全长蛋白在检测AQP4抗体中的差异。目的1.通过构建pE

6、T32a(+)-AQP4的胞外区的原核表达质粒，表达AQP4的胞外区蛋白，建立一种可用于检测AQP4抗体的ELISA方法。I2.利用重组质粒pCMV6-AC-GFP-AQP4转染HEK293细胞，表达AQP4全长蛋白，建立用于检测抗AQP4抗体的CBA方法。方法1.利用生物信息学软件TMHMM2.0分析人AQP4的结构，并根据大肠杆菌的密码子的偏好性设计合成AQP4胞外区的寡核苷酸序列。2.利用分子克隆技术构建pET32a(+)-AQP4胞外区的原核表达质粒。3.构建的重组表达质粒通过转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，利用IPTG进行

7、诱导表达蛋白，然后通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。2+4.大规模培养宿主菌并诱导表达目的蛋白，利用Ni离子亲和层析技术进行蛋白质的纯化，目的蛋白经过SDS-PAGE电泳和Westernblot的鉴定。5.利用纯化酶切的目的蛋白包被ELISA微孔板，通过国际公认检测AQP4抗体的金标准间接免疫荧光法筛选的阳性血清对表达蛋白的生物活性进行评估。6.通过脂质体转染技术将重组质粒pCMV6-AC-GFP-AQP4转染HEK293细胞，并同时用pCMV6-AC-GFP转染细胞作为对照。对转染细胞进行固定后进行后通过间接免疫荧光法检测NMO患

8、者患者血清中的抗体。结果1.限制性内切酶和测序分析均鉴定重组表达质粒构建正确。2.经过SDS-PAGE电泳鉴定，构建的pET-32a(+)-AQP4胞外区的原核表达质粒的宿主菌经诱导表达的蛋白可以可溶性的表