应用cell-selex筛选panc-1细胞适配体技术研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士专业学位论文论文题目应用CELL-SELEX筛选PANC-1_________________细胞适配体技术研究研究生姓名________________鲍立新__________指导教师姓名___________th'共1F春丰色专业名称_______________制药工程_________研究方向论文提交日期______________2015年玥苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个

2、人或集体已经发表或撰写过的研宂成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者:日期:X'夕，苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许

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4、胰腺癌细胞PANC-1为靶细胞进行适配体筛选研究。在对照细胞选择上引入了一种新的对照细胞选择策略，并确定了A549细胞为对照细胞的反向筛选。细胞状态稳定对适配体筛选非常重要，本文通过高传代频率的培养策略来维持细胞在整个筛选过程中状态稳定。结合软件与PCR扩增协同分析，对引物序列、PCR扩增效率和抗干扰性进行考察，确定了本文所用引物在细胞适配体筛选中的适用性。PCR在CELL-SELEX中被广范用于扩增次级文库。随机文库为模板的PCR难度大，不确定因素多。本文采用多种PCR方法对随机文库PCR特点进行考察。发现退火温度调节对扩增效率影响明显，

5、对非特异性扩增作用较小；随机文库PCR对程序循环数极其敏感，循环数远少于常规PCR，对扩增效率和选择性影响较大。在次级文库PCR方法优化中，总结出一套具有广泛适用性的PCR优化策略，对细胞适配体筛选次级文库PCR具有指导意义。在次级文库制备中，针对单链分离过程建立了相应的监控办法，可对过程及时反馈，并确定待回收样品。通过延长PCR产物与Streptavidin-Agarose孵育时间，提高了分离柱对PCR产物的固载效率。借助核酸助沉剂（Acrylcarrier），建立了适用于适配体筛选ssDNA乙醇低温沉淀回收方法，可以选择性回收目的ssD

6、AN，回收率在80.0%以上。同时解决了ssDNA脱盐、PH平衡和ssDNA浓缩的问题。并建立了相应的定量表征方法。筛选是CELL-SELEX的主要内容，本文对细胞适配体筛选与筛选强度调整方法进行了研究。确定了5种基本筛选强度调整方式（细胞数量、ssDNA孵育浓度、孵育时间、孵育摇床转速和孵育后洗涤），发现5种调整方式之间的协同关系，确定了I中文摘要应用CELL-SELEX筛选PANC-1细胞适配体技术研究细胞量与文库孵育浓度在筛选强度调节中的基础地位，以及孵育后洗涤条件中洗涤时间在洗涤强度中的决定性作用。通过本次细胞适配体方法学研究成功搭

7、建了PANC-1细胞适配体筛选平台，并初步筛得了PANC-1高亲和的候选适配体群。关键词：CELL-SELEX，适配体，方法学，PANC-1，文库引物，PCR，次级文库制备，筛选作者：鲍立新指导老师：谢洪平闵春艳II应用CELL-SELEX筛选PANC-1细胞适配体技术研究英文摘要TechnologystudyofPANC-1cellaptamerselectionbasedonCELL-SELEXAbstractCellaptamerselectioncangeneralizeforthefollowingfouraspects:prel

8、iminarypreparation,PCRamplification,secondaryssDNApoolpreparationandselection.Basedonthis