高级生物化学实验报告

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1、高级生物化学实验报告实验一猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老。抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机

2、体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机容易沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下

3、方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000μg。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所

4、产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氧化硝基四氮唑蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处应无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布活性大小）。二、实验试剂与器材【试剂】1、SOD的提取ACD抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml；0.9%NaCl：称取NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中；丙酮95%乙醇氯仿2、SOD活力测定50mmol/LpH8.3磷酸缓冲

5、液10mmol/LEDTA钠盐溶液3mmol/L邻苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配置）3、考马斯亮蓝G-250法测蛋白质考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白质25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。4、SOD同工酶鉴定40%蔗糖（W/V）：称取蔗糖加重蒸水100ml

6、；10%过硫酸铵（Ap）：称取过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中，用时现配；’点击缓冲液：称取三是用现配羟甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml。用时稀释10倍。30%的Acr-Bis溶液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4℃保存；Tris-HCl，pH8.9缓冲溶液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，加1mol/LHCl48ml，TEMED0.4ml，用浓盐酸调pH8.9后，再用蒸馏水定容至100ml；Tris-HCl，pH6.7缓冲溶液：T

7、ris（三羟甲基氨基甲烷）6.0g，加1mol/LHCl48ml，TEMED0.4ml，用浓盐酸调pH6.7后，再用蒸馏水定容至100ml；NBT溶液：核黄素（0.01%），氯化硝基四氮唑蓝（NBT）（25mol/L），磷酸缓冲液（0.05mol/L、pH7.8），EDTA-Na2（1.0mol/L）2.8X10-3mol/L的EDTA-Na2（用pH7.8,3.6X10-3mol/L磷酸缓冲液配置）【器材】752分光光度计，分析天平，具塞试管，刻度吸管（1ml，5ml），离心机，烧杯（50ml），电泳装置一套，微量进样器，注射器。

8、三、操作步骤1.SOD的提取[1]取新鲜猪血20ml（预先按0.15:1（V/V）的比例加入ACD抗凝剂）于50ml离心管，4000r/m，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4