GnRH基因对鲤鱼性腺发育调控机制的初步研究

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1、中国科学院理学博士学位论文GnRH基因对鲤鱼性腺发育调控机制的初步研究徐婧导师：朱作言研究员中国科学院院士胡炜研究员专业：遗传学中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072，中国二零零九年八月一令苓7L，牛八月DoctoralDissertationPrimarystudiesontheregulationmechanismunderlyinggonadaldevelopmentbyGnRHincommoncarp(CyprmuscarptoL·J，J’‘●T、XuJingSuperviso

2、r：Prof．ZHUZuoyan，AcademicianofCASProf．HUWeiMajor：GeneticsGraduateSchooloftheChineseAcademyofSciencesInstituteofHydrobiology，theChineseAcademyofSciences，Wuhan430072Hubei，P．R．ChinaAugust，2009中文摘要鱼类的性腺发育是相关基因时空表达、内分泌因子及环境等多因素综合作用的结果，其中涉及多种信号分子介导的复杂网络调控。在这个复杂的动态调控过程

3、中，下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonadaxis，HPG)是主要的信号传导轴。促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，GnRH)是鱼类HPG轴的起始信息分子，对于鱼类的性腺发育、繁殖功能的维持起至关重要的作用。本实验室采用“转反义基因”技术，即通过显微注射方法，将编码sGnRH的反义cDNA注射至鲤鱼受精卵，通过特异阻遏受体鲤鱼发育过程中sGnRH基因的表达，在实验室获得性腺发育被抑制的鲤鱼。抑制GnRH基因的表达，从源头上破坏了鱼类性腺

4、发育调控网络的平衡，导致这一信号传导调控网络中重要信号因子的变化。我们利用这一独特的试验模型，开展鱼类性腺发育的调控机制研究。因此，本论文以实验室研制获得的性腺发育被抑制的鲤鱼为模型，同时以性腺正常发育的鲤鱼为材料，分别构建了下丘脑、垂体、性腺三个层次的抑制性差减杂交文库，将筛选得到的15，998个克隆点制芯片，对下丘脑、垂体、性腺三个层次的差异表达基因进行筛选，将筛选得到的基因进行生物学信息分析，取得如下结果：1、转反义sGnRH基因鲤鱼及其对照鲤鱼性腺发育特性研究发现，转基因鱼性腺发育指数显著低于对照鱼：同时切片结

5、果显示，转基因鱼卵巢主要由处于II期的初级卵母细胞组成，对照鱼的卵巢卵母细胞则进入了成熟期，处于发育阶段的Ⅳ期。结果进一步表明反义sGnRH能在成鱼体内有效地发挥作用，进而证实sGnRH是HPG轴中控制鱼类性腺发育的关键因子。2、在下丘脑水平，从挑取的4,996个克隆中筛选到9种差异表达基因。9种差异基因中存在重复3次的黑色素聚集激素前体和重复8次的与黑色素形成相关的与人恶性黑色素瘤中筛选到基因同源的未知基因。相关结果提示我们，与黑色素形成相关的因子参与鱼类性腺发育调控，并可能受sGnRH的调节。3、在垂体水平，筛选得

6、到198个差异片段，将差异片段去除重复后，得到博士学位论文G前{基因对鲤鱼性腺发育调控机制的初步研究28个差异表达基因。其中促性腺激素(gonadotropin，GTH)B—I亚基重复124次，GTHct亚基重复13次，但是没有筛选到GTHB．II亚基。该结果证明在垂体水平，GTHI是sGnRH的一个主要靶基因，GTHI在鱼类性腺发育的早期起主导作用。垂体水平还发现，与钙离子结合相关的基因下调表达，提示反义sGnRH可能通过下调Ca2+所介导的GnR．H对GTH的信号传导途径活性，导致GTH表达水平的降低。在垂体水平，

7、差异表达最高的基因除GTHI基因外，还有生长激素(growthhormone，GH)、阿黑皮素原(pro—opiomelanocortin，POMC)等基因，表明GnRH不仅调控生殖轴，同时还对生长轴、下丘脑．垂体．肾上腺皮质轴具有调节作用。另一方面，GH、POMC对性腺的发育也具有反馈作用，所以这3个轴之间存在着复杂的交互的网络调控。4、在性腺水平，筛选得到843个差异表达片段，去除重复序列后，得到212个差异表达基因。差异表达基因包括与卵母细胞的成熟相关的基因如3种印、h2a等，以及与结构分子活性、结合活性、免疫调

8、节等相关的基因。其中，与结构蛋白相关基因在差异表达的基因中所占比重最大，表明在性腺发育的过程中，该类基因有序的时空表达对于维持卵母细胞周围组织及细胞外基质的结构发挥着重要的作用。免疫相关基因在性腺中的差异表达，表明鱼类排卵过程有免疫分子的参与，为“鱼类的排卵是一种炎症反应”的观点提供了重要的分子证据。此外，性腺中筛选得到的73个未