Bcl2和IL10基因转染对移植心脏保护作用及机制研究

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1、华中科技大学博士学位论文Bcl-2和IL-10基因转染对移植心脏保护作用及机制研究姓名：高思海申请学位级别：博士专业：外科学胸心外科指导教师：杨辰垣2003.4.1华中科技大学同济医学院2003届博士论文Bcl—2和IL_10基因转染对移植心脏保护作用及机制研究博士研究生高思海导师杨辰垣教授摘要，／细胞凋亡(apoptosis)，一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，参与了心脏移植再灌注损伤及移植排斥反应的整个过程，是心肌细胞损伤的重要表现形式。Bcl一2(B淋巴细胞瘤／白血病．2基因)是目前发现的最强的抗凋亡基因，具有

2、维护线粒体膜的完整性及生理通透性的重要作用。细胞因子(cytokines)作为细胞间信号传递分子介导和调节免疫应答，在心脏移植排斥反应中发挥重要作用。通过调节细胞因子谱系，能有效抑制心脏移植排斥反应。几．10(自细胞介素10)是T辅助细胞产生的以抑制Thl细胞因子合成为特＼．／～—一点的高效免疫调节因子，能强力抑制移植排斥反应。上／P／本课题通过构建Bcl-2和IL．10腺病毒载体，转染小鼠移植心脏，探讨Bcl一2和IL．10基因转染对移植心脏的保护作用及机制。从细胞凋亡和细胞因子两方面探讨如何有效地控制心脏移植后的再

3、灌注损伤和移植排斥反应，为基因治疗应用于临床心脏移植提供了实验依据及理论基础。本课题共分八部分：f第一部分)夕、一／。Bcl-2重组腺病毒载体的构建及鉴定／厂目的通过构建Bcl．2重组腺病毒载体，以研究Bcl．2高表达对心脏移植排斥及缺血再灌注所导致的细胞凋亡的影响。方法将Bcl．2cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV-linkl，利用体内同源重组原理，用该重组质粒与pJMl7质粒共转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒AdCMV／Bcl．2，其中Bcl．2cDNA插入腺病毒基因组的El区，并由CMV启动子控制。

4、利用限制性酶切、PCR共扩增技术鉴定重组腺病毒。结兰主型垫查兰旦苎垦兰垦三竺三星苎主丝塞——一累从感染AdCMV／BcI．2重组腺病毒的293细胞中检测到Bcl一2的表达霪组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内迸行有效复制。结论本研究成功地构建了Bcl·2重组腺病毒，为进一步研究Bcl．2重组腺病毒的功能提供了条件≯，p～一f关键词】Bcl．2；腺病毒载体；基因治疗，』9，、／t一7’／第二部分r’‘．一IL-10重组腺病毒载体的构建及鉴定‘r／目的通过构建IL-10重组腺病毒载体，以研究IL．10商表达对心脏移植排

5、斥反应及移植心脏存活时间的影响。方法将IL-10eDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV-linkl，利用体内同源重组原理，用该重组质粒与剑rMl7质粒共转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒AdCMVfIL-10，其中IL．10cDNA插入腺病毒基因组的El区，并由CMV启动子控制。利用限制性酶切、PCR共扩增技术鉴定重组腺病毒。结果从感染AdCIVIV／IL．10重组腺病毒的293细胞中检测到IL．10的表达：重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效复制。结论本研究成功地构建了几．10重组腺病毒，为进一

6、步研究几．10重组腺病毒的功能提供了条件。【关键词1也．10；腺病毒载体；基因治疗^／陟’一f第三掷分k—。一、，岁．小鼠颈部心脏移植模型的建立及改进f日的探讨小鼠颈部心脏移植术的改进和研究心脏移植排斥反应。方法将(?hen术式加以改进，采用供心主动脉与受体颈总动脉行端侧吻合，进行60次小鼠颈部心脏移植t结果新方法使供心总缺血时间缩短至40分钟，7天存活率为90％。结论改进的术式简单实用，有较高的存活率，值得推广。[关键词]一II,脏移植；异位移植；小鼠』虹“～华中科技大学同济医学院2003届博士论文f第四部分土／p一

7、簪Bel一2基因转染对移植心脏的保护作用及机制研究／实验一Bel—2基因转染对心脏移植再灌注损伤的保护作用及机制研究目的探讨Bcl一2基因转染对心脏移植再灌注损伤的保护作用及机制。方法采用小鼠颈部心脏移植模型，BALB／C小鼠，随机分为3组：对照组，移植组，Bcl一2组。术后24小时测定血清心肌酶谱LDH、GOT、GPK及血清脂质过氧化终产物^lDA、过氧化物歧化酶SOD的含量；取移植心脏，用免疫组化方法观察Bcl-2的表达情况。采用反相高效液相色谱法测定心肌ATP含量。原位末端标记(TUNEL)法染色检测心肌细胞凋亡

8、，以心肌细胞凋亡阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为心肌细胞凋亡指数(apoptosisindex。AI)。电镜观察心肌组织的显微结构变化。结果Bcl一2组心肌细胞高表达Bcl一2，与移植组相比，心肌线粒体等结构的损伤明显减轻，血清心肌酶谱明显改善(P