钠泵抑制介导的细胞死亡特征和机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文钠泵抑制介导的细胞死亡特征和机制研究姓名：王娜申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：呼文亮;徐瑞成20070301中文摘要钠泵抑制介导的细胞死亡特征和机制研究摘要目的：本研究采用人脐静脉内皮细胞ECV304为靶细胞，观察钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)对细胞死亡、细胞连接、细胞内游离Ca2+和活性氧自由基(ROS)的影响；检测哇巴因作用细胞前后钠泵a1亚单位、Bl亚单位、VE．cadhedn和Snail基因表达的改变，探讨钠泵抑制介导的细胞死亡特征和作用机制。方法：(1)M

2、TT比色法检测哇巴因对细胞的生长抑制作用。(2)倒置光显微镜、透射电子显微镜观察细胞形态结构改变；Hoeehst33342／PI双荧光染色，荧光显微镜观察细胞死亡特征，区分凋亡细胞与坏死细胞。(3)激光共聚焦显微镜观察血管内皮细胞内游离Ca2+、活性氧自由基。(4)琼脂糖凝胶电泳分析凋亡细胞DNA片段。(5)半定量盯PCR法检测哇巴因对钠泵a1和p1亚单位mRNA的表达以及VE．cadherin、Snail基因mRNA表达的影响。结果：(1)生长抑制作用：哇巴因可抑制ECV304细胞生长，且呈浓度一时间依赖性；高浓

3、度哇巴因(10pmol／L)对细胞有剧烈抑制作用，而低浓度(O．0011amol／L)对细胞的增殖抑制作用有明显降低。经直线回归计算24h、48h、72hIC卯值分别为0．624、0．184、0．04pmol／L。(2)细胞形态学改变：ECV304为贴壁生长型细胞，哇巴因作用后细胞出现明显的形态学变化。5。lOI_unol／L的哇巴因作用细胞后，12。24h内引起细胞死亡，给予0．1pmol／L哇巴因干预24中文摘要．48h，细胞变圆，细胞间缝隙增大，细胞折光性较差，随着作用时间的延长，细胞肿胀、破碎、死亡。而0．

4、01．O．0010mol／L哇巴因处理后，与对照组相比无明显改变。电镜下可见凋亡细胞中，细胞器变性，染色质边集，沿核膜内缘呈团块状分布；同时可见胞浆空泡，胞质崩解等典型坏死细胞的特征I另外，哇巴因作用后细胞间连接消失。荧光显微镜下可见，10pmoFL哇巴因组细胞剧烈坏死成红色；O．1“rnol／L哇巴因组细胞染色质浓缩呈亮珠状并形成凋亡小体等典型的凋亡形态学改变。(3)琼脂糖凝胶电泳结果：0．1lunol／L的哇巴因处理ECV304细胞48、60h，从中提取的DNA电泳，O．1I_tmol／L哇巴因作用48h后，D

5、NA琼脂糖凝胶电泳显示较典型的DNAladder带；随着作用时间的延长，死亡细胞增多，60h后出现sn'tear条带。(4)哇巴因作用后细胞内Ca2+浓度、氧自由基含量升高，且二者均呈浓度一时问依赖性。(5)哇巴因对钠泵al和Bl亚单位mRNA表达的影响：哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵al亚单位的表达，下调Dl亚单位表达，且两者均呈浓度一时间依赖性。与对照组比较，随着哇巴因浓度的增加、作用时间的延长，钠泵al亚单位mRNA表达明显升高；相反，pl亚单位mRNA表达降低。(6)哇巴因对VE．cadherin和S

6、nail基因mRNA表达的影响：RT-RCR结果显示：哇巴因能浓度一时间依赖性下调Ⅶ．cadherin表达、上调Snail表达。随着哇巴因作用浓度的增加和作用时间的延长，VE．cadherin基因mRNA表达逐渐下降，相反Snail基因mRNA表达逐渐升高，且二者的表达存在逆反关系，Snail在转录水平抑制VE．caadherin的表达。中文摘要结论：(1)哇巴因可明显抑制ECV304细胞的生长，抑制作用呈现浓度一时间依赖性。(2)不同浓度哇巴因对血管内皮细胞的作用不同：高浓度可短时间引起细胞坏死，而低浓度可诱导细

7、胞凋亡。(3)畦巴因作用后细胞内Caz+浓度增加、氧自由基含量升高。(4)哇巴因能浓度一时间依赖性上调钠泵al亚单位和Snail基因的表达、下调Bl亚单位和VE．eadherin基因表达；131亚单位和VE．cadherin表达共同降低，同时Snail抑制Ⅶ-cadherin的表达，从而使细胞间黏附降低，细胞问连接丧失，细胞脱落死亡。由此推测，哇巴因对血管内皮细胞的作用与钠泵亚单位介导信号传递，降低细’胞黏附有关。关键词：哇巴因；细胞死亡；细胞连接；钠泵亚单位：VE．eadherin；Snail；游离Ca2+；氧自

8、由基英文摘要EffectofNa+,K+-ATPaseInhibition011GrowthandDeathofVascularEndothelialCellsandItsMechanismsABSTRACTobieetive：TostudytheeffectofNa+．K+-ATPaseinhibitionbyouabainoncellgrowth，cel