古尼虫草无性型古尼拟青霉519菌株活性多糖的研究

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1、贵州大学硕士学位论文古尼虫草无性型古尼拟青霉5-19菌株活性多糖的研究姓名：肖建辉申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：梁宗琦;刘爱英20020601贵州大学2002届硬士研究生学位论文古尼虫草无性型古尼拟青霉5-19菌株括性多糖的研究摘要本文对来自古尼拟青霉P口ecⅣ。叼，ce5gMH“Liang5-19菌株胞内多糖(以下简称“PGPs”)采用正交试验优化了PGPs提取工艺及条件：用sevag法和酶法脱蛋白．H202氧化法和大孔吸附树脂层析柱去色素．再利用DEAE—sephadexA一25(CI_)层析柱和sephadexG．2

2、00层析柱进行分离纯化。将不同纯度的PGPs及PGPs经处理获得的各组分(以下简称“处理组分”)，用MTT(噻唑蓝)法、中性红比色法和溶血素试验法分别测定试验动物Bal”c小鼠的脾淋巴细胞转化、腹腔巨噬细胞(PMm)吞噬功能和细胞毒T淋巴细胞(cTL)活性及体液免疫功能。结果表明．PGPs及其不同处理组分对试验动物具有不同程度、不同作用的免疫的调节作用．特别值得重视的是虫草粗多糖的降解物中存在具明显免疫抑制作用的组分尚未见报道，这为虫草多糖的综合开发利用提供了新的线索和可贵的科学依据。PGPS的提取分离工艺及其定性定量分析。经比较试验

3、观察到较好的提取荆是蒸馏水，沉淀剂为乙醇：优化后的提取工艺是1份脱脂菌粉，加10倍菌粉量的蒸馏水，70℃条件下浸提2小时(浸提3次)，合并浸提液浓缩至其总体积的1，6，加入乙醇使其终浓度95％，醇析12小时．PGPs得率达到19．1％。采用Sevag和酶法联合脱蛋白，大孔吸跗树脂层析柱去色素同时分离纯化PGPs；用改良的苯酚一硫酸法测定PGPs的多糖含量为13．9％。PGPs中含有结合蛋白的多糖组分．经提纯后．茚三酮法检测未发现蛋白质。PGPs及其各处理组分的免疫抑制活性。PGPs、PGPs半精制品及PGPs经化学法和物理法降解获得的

4、备组分对小鼠脾淋巴细胞转化、腹腔巨噬细胞(PMo)吞噬功能、cTL活性和溶血素水平大部分有免疫抑制作用，其中经降解的PGPs有显著的免疫抑制括性。此外，PGPS半精制品经超声波降解后，再上DEAEsephadexA一25层析柱分离获得的各组分也不同程度的抑制小鼠脾淋巴细胞转化；其未经降解，但依次上DEAES印hadexA一25层析柱和SephadexG-200层析柱纯化得到的组分则促进小鼠脾淋巴细贵州大学2002届硕士研究生学位论文古尼虫草无性型古尼拟青霉5．19菌株活性多糖的研究胞转化。PGPs中不同组分阃及其与其它多糖间存在的相互

5、作用。PGPs含有多种物质和多糖组分，PGPs、PGPs半精制品以及PGPs经化学法和物理法降解后的各处理的生物活性不同，这些差异可能与它们不同组分问存在相互作用有关。PGPs与5．19菌株胞外多糖均抑制淋巴细胞转化，等量混合后则呈促进作用；PGPs与粉被虫草c．pr“加os日2281菌株胞内多糖等量混合后显著抑制淋巴细胞转化。PGPs与其它多糖间存在不同的协同作用。微生物发酵PGPs对其括性的影响。将PGPs作为5一19、2281、157和159等菌株的唯一碳源和能源加入培养基后．经培养一定时间获得的胞外组分呈促进淋巴细胞转化，尤其

6、是经159菌株获得的胞外组分有显著的促进作用。微生物利用转化PGPs进而影响免疫效果的现象很值得进一步研究。关键词：古尼虫草，古尼拟青霉，活性多糖，免疫抑制，协同作用，微生物转化2贵州大学2002届硕士研究生学位论文古尼虫草无性型古尼拙青霉5，19菌株活性多糖的研究前言虫草属真菌是一类独特类型的真菌，其中某些种类具有丰富而特殊的化学成分和生物活性，如冬虫夏草【c。r咖c印ssi”e"s括(Berk．)Sacc．】、蝉花【cJ06D?毋m(H札)Berk．]、大团囊虫草[c．印^iog如ssDid∞(Ehrenb．)Link]等虫草属真

7、菌已有数百年药用史，是我国的名贵中药。来源于虫草类的真菌菌丝制品和发酵产物与天然虫草有相似的化学组分和生物活性．因此，虫草的开发利用除主要集中在冬虫夏草、大团囊虫草、蝉花等少数几个种的第一层次——菌体的直接利用外．国内外学者在冬虫夏草代用品方面傲了大量卓有成效的工作。在虫草资源层次上．致力于其它虫草野生资源物种与种群生物量更为丰富的虫草无性型及相关真菌代用品的研究开发”I。近十几年来，虫草无性型及相关真菌工业生产技术逐步成熟并实现产业化f“。用分离白冬虫夏草的几种非真正无性型真菌，蝙蝠蛾拟青霉[忍∞肋mE∞^印曲棚、中华头孢霉fc印^

8、d，D印。rfms加emj小蝙蝠蛾被孢霉【^如r，妇M，，口^印，。，f】等来源于冬虫夏草的相关真菌以及大孢虫花[P∞，印Dn七d1血suda】等菌种生产的原料制备的各种剂型产品或与名贵中药配伍的复方制品，如“至灵”胶囊