《谷氨酸发酵培养基》PPT课件

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1、生物素亚适量法生产谷氨酸组员李振国芦敏刘祺陆姗姗李雷达董呈呈万东刘玉洋一、实验目的1、掌握谷氨酸发酵的原理2、掌握谷氨酸种子制备的方法3、掌握谷氨酸发酵过程中的条件控制4、掌握谷氨酸发酵液提取谷氨酸的方法5、掌握谷氨酸纯化的方法6、探究不同糖浓度对菌种生长的影响二、发酵原理1.合成途径谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷

2、氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂

3、的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。发酵原理2.发酵过程在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：①氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。②温度。菌种生长的最适温度为30～32℃。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34～37℃。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0～8.0

4、。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。发酵结束后，常用离子交换树脂法等进行提取。三、实验试剂与仪器试剂：葡萄糖、尿素、硫酸镁、磷酸氢二钾、玉米浆、硫酸亚铁、硫酸锰、水解糖、玉米浆、K2HPO、MgSO4、尿素、FeSO42ppm、MnSO4、NaS、活性碳仪器：500ml三角瓶2个、接种环、酒精灯、摇床、超净工作台、抽滤装置、

5、烧杯、试管、发酵罐、离子交换柱、PH试纸或者PH计、1L量筒2个、200ml三角瓶5个、高压锅操作步骤1．一级种子培养工与制：按下列培养基配方配制1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121℃灭菌30min冷却备用。葡萄糖2.5%尿素0.5%硫酸镁0.04%磷酸氢二钾0.1%玉米浆2.5~3.5%硫酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.02．一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的种子培养基中（250ml三角瓶内接入1~2环）于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养12h。一级种子质量要求：种龄12

6、hpH6.4±0.1光密度：净增O.D值0.5以上无菌检查阴性，噬菌体检查无。四、操作步骤3．二级种子培养基配制：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121℃灭菌30min冷却备用。水解糖2.5%玉米浆2.5~3.5%K2HPO40.15%MgSO40.04尿素0.4%FeSO42ppmMnSO42ppmpH6.8~7.04．二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.5~1.0%接入上述已培养好的一级种子，于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养7~8h，二

7、级种子质量要求：种龄7~8hpH6.8~7.2OD值净增0.5左右无菌检查（一）、噬菌体无、残糖消耗1%左右镜检生长旺盛，排列整齐，G+操作步骤5．发酵培养基配制按下列培养基配方制发酵培养基，并按20%装液量分装于250ml三角瓶中，水解糖10%，甘蔗糖蜜0.18~0.22%，玉米浆0.1~0.15%，Na2HPO40.17%，KCl0.12%、MgSO40.04%，用NaOH（5%）溶液调pH7.20于110℃灭菌20min冷却备用。6．发酵：按8~10%的接种量在发酵培养基中接入合格的二级种子注，于35℃±1

8、℃、250r.p.m条件下发酵35h，发酵过程中①从第4h后开始用无菌注射器补入尿素，尿素流加按pH值进行控制即8h前pH7.0~7.6；8h后pH7.2~7.3，20~24hpH7.0~7.1，24~35h，pH6.5~6.6。尿素流加总量为4%。②从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。7．镜检及谷氨酸测定：在8h及2