《电泳技术方王楷》PPT课件

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1、电泳（electrophoresis）电泳的基本原理带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F＝QX质点的前移同样要受到阻力（f）的影响，对于一个

2、球形质点，服从Stoke定律，即：f＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度）当质点在电场中作稳定运动时：F＝f即：QX＝6πrην迁移率u：单位电场强度下的电泳速度，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。u＝v/E=q/6πrηv=QX/6πrη在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即V＝d/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即X＝E/L。将这两个公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/

3、Etd=u*Et/L由此可以得到两种物质移动距离的差为△d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。影响因素1.待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快2.缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带

4、相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。3.电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置4.电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。5.支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大分类按支持介质的不同可分为：⑴纸电泳（Pape

5、relectrophorisis）⑵醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）⑶琼脂凝胶电泳（AgarGelelectrophoresis）⑷聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelelectrophoresis）（PAGE）⑸SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。按支持介质形状不同可分为：⑴薄层电泳；  ⑵板电泳；  ⑶柱电泳聚丙烯酰胺电泳（PAGE）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳目的：1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.熟悉电泳仪器的

6、使用和操作原理：血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、α1、α2、β、γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。实验操作步骤及注意点1、准备与点样1）将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端2cm处点样（膜不能折；在膜上标记记号）。2）用点样器蘸血清少许（不能看见有液滴形成），按在

7、点样处（点样要与膜边缘垂直，且大小均匀）。2、电泳将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极紧密接触（不能留有气泡），平衡5min。通电，电压100V,时间1h。3、染色电泳结束，将膜放入氨基黑10B染色，3min后取出，漂洗，反复几次，至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。4、定量1）取6支试管并编号，分别加入0.4N氢氧化钠4ml。2）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带（空白带的宽度以最窄的条带为准，why？），将各条带浸入试管，不时摇动，洗脱蓝色。3）光光度计比色，波长为650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照

8、，读取其它5管的光密度值。5、计算总吸光度光密度总和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ各部分蛋白质的百分数：蛋白质％＝A/T×100％+白蛋白(A)α1α2βγ等电聚焦电泳不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分离。蛋白质具有许多可解离的酸性基团（－COOH）和碱性基团（－NH2）及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的