大豆转座子Tgm9转座机制的研究

《大豆转座子Tgm9转座机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：Ｑ２学校代码：１０６９７密级：公开学号：２０１５２０８６４ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩ？士字位论文ＭＡ’ＳＴＥＲＳＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ夭豆转座子７抑＾转座机制的研究学科名称：细胞生物学：常恩洁指导老师作．者：徐敏副教授西北大学学位评定委员会二？一八年MolecularstudyontheexcisionmechanismofsoybeantransposonTgm9AthesissubmittedtoNorthwestUnive

2、rsityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinCellbiologyByChangEnjieSupervisor:XuMinAssociateProfessorMarch2018摘要大豆转座子Tgm9转座机制的研究摘要Tgm9是大豆中最早发现的具有转座活性的转座子，以“剪切-粘贴”形式进行转座，其末端具有反向重复序列CACTA，3’亚末端高度重复，编码两种参与自身转座的转座酶Transposase1(TNP1)和Transpo

3、sase2(TNP2)。目前为止，Tgm9的转座机制尚不清楚，通过序列之间的对比，我们发现玉米转座子En/Spm编码的转座酶TNPD与TNP2具的有较高的相似性，推测TNP2的功能与TNPD相近，具有核酸内切酶的活性；通过分析TNP1的二级结构，我们发现TNP1具有DNA结合的功能。通过对转座酶功能的分析以及结合CACTA家族其他成员的转座机制，猜想Tgm9的转座机制为：TNP1分别结合到转座子的两端的末端序列，通过TNP1与自身的相互作用将转座子拉成环状，TNP1招募具有核酸内切酶的功能的TNP2，将转座

4、子切割下来。验证以上猜想需首先证明：转座酶亚细胞定位在细胞核，转座酶之间有相互作用。将转座酶与GFP融合表达，通过烟草瞬时表达实验，确定转座酶的亚细胞定位；通过荧光双分子互补实验（bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC）以及酵母双杂交实验（yeasttwo-hybridY2H）探索转座酶之间的相互作用，最后在前两个实验结果的基础上对转座酶进行分段，进一步探索核定位信号以及在相互作用中起关键作用的区域。研究结果如下：我们将TNP1/TNP2分别构建到植物双元表达

5、载体pCAMBIA3300中，以2x35S为启动子，卡那霉素（Kan）为筛选标记，绿色荧光蛋白（GFP）为报告标记，我们通过烟草瞬时表达，使用激光共聚焦显微镜观察得到以下结论：TNP1亚细胞定位在细胞核以及类似细胞骨架的丝状结构；TNP2亚细胞定位在细胞核。我们将TNP2和TNP1分别与YFP的N末端片段和C末端片段融合表达，我们通过荧光双分子互补实验，使用激光共聚焦显微镜观察得到结论：TNP2与TNP1可以互作发生在细胞核中；TNP1可以与自身互作，发生在细胞核以及丝状结构；TNP2则不能与自身互作。酵母

6、双杂交实验的结果显示转座酶之间不能互作，为了确保实验的结果的I西北大学硕士学位论文可靠性，我们通过westernblotting从蛋白水平上检测转座酶在酵母细胞中的表达情况，发现转座酶在酵母中不能稳定表达，所以酵母双杂交的结果为假阴性。为了进一步分析TNP2各个片段的作用，我们将TNP2按照一定的方法分段，通过烟草瞬时表达实验，使用激光共聚焦显微镜观察GFP信号，得到以下结论：TNP2618-928、TNP2928-1058区域有核定位信号，通过BiFC实验，使用激光共聚焦显微镜观察GFP信号，得出结论TN

7、P2618-928、TNP2928-1058可以与TNP1在细胞核中互用。为了进一步分析TNP2各个片段的作用，我们将TNP1按照一定的方法分段，通过烟草瞬时表达实验，使用激光共聚焦显微镜观察GFP信号，得以下结论：TNP1的N端、C端都有核定位信号，定位在丝状结构信号位于N端。通过BiFC实验，使用激光共聚焦显微镜观察GFP信号，得出结论C端100个氨基酸在与自身的相互作用中起关键作用。TNP1200-755、TNP1200-655、TNP1200-555可以与TNP2在细胞核中相互作用。因为我们没有从大

8、肠杆菌中纯化出TNP1、TNP2，所以无法验证TNP1是否具有识别并特异性结合到转座子的两端的末端重复序列的功能，TNP2是否具有核酸内切酶的功能。下一步可以尝试在植物中纯化TNP1、TNP2。通过以上实验，初步验证了以上对Tgm9转座机制到的猜想，我们已经证明了TNP2亚定位的细胞核中；TNP1定位在细胞核以及丝状结构；TNP1可以与TNP2相互作用；TNP1可以与自身相互作用。我们猜想转座酶的大小会影响转座发