水稻齿叶矮缩病毒基因组S8和S10片段的原核表达及抗血清制备

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1、福建农林大学硕士学位论文水稻齿叶矮缩病毒基因组S8和S10片段的原核表达及抗血清制备姓名：丁新伦申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：段永平;吴祖建20050401独创性声臻本人声l扎赝生交蚋学经￡。#渡)沧文，址托精曹教9+lJt++',jjt-l-；罾h丑苴过我的努力取得的成果，弗H足I'-I己撰’，誓的。尽我所知l，除了史rl一们j‘“洼驯敢叫·}·已馋J’h-测∞地龙外+沦史mtl：毡3jI他人发&戏捌’；过☆弘护j妇《戳，，‘，我巾日对奉研究做出贫

2、虢的嗣j盘，鄢在沱文tf，彳{；了吲确的Ij己}!jj并&，JiJ’谢．0、．如被态钉侵犯他人知识产投的行为，出本

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6、缩病毒(Riceraggedstuntvirus，RRSV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员，引起水稻齿叶矮缩病，是东南亚、东亚、和南亚一些国家局部发生的病害。RRSV基因组包括10条双链RNA片段(S1一S10)，本文报道了福建农林大学植物病毒研究所分离纯化并经室内保存20多年的RRSV福建沙县分离株(RRsV-F)的基因组s8和s10片段的编码区克隆、原核表达、Pnsl0融合蛋白抗血清的制备和P8蛋白的系统进化分析结果。通过有机试剂抽提，CF一1l纤维素柱层析，从感病水稻N-r片中获取该病毒的全基因组，根据RRSV泰国分离株

7、(RRSV-T)S10开放阅读框(ORF)核苷酸序列(nt142．1035)和s8开放阅读框核苷酸序列(nt23．1810)分别设计引物，通过RT--PCR方法扩增出特异性目的条带。PCR扩增产物经回收、连接、转化DH5a大肠杆菌克隆至pMDl8一T载体上，经蓝白斑和氨苄青霉素抗性筛选和双酶切和PCR法鉴定，分别获得了重组质粒pMDl8-TS10和pMDl8-TS8，并进行了序列测定和分析。RRSV-F和RRSV-T分离物s10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99．66％年D99．83％，而RRSV-F和RRSV-P分离物S8基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99．72％

8、矛N99．87％，RRSV-F和RRSV-T分离物S8基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99．61％和99．75％，并在氨基酸水平上构建了呼肠孤病毒科部分侵染植物的呼肠孤病毒和褐飞虱病毒(NLRV)外层衣壳蛋白系统进化树，结果表明RRSV与斐济病毒属亲缘关系较近，与植物呼肠孤病毒属亲缘关系较远。本文利用DirectionalTOPO克隆技术将平整末端单向克隆的S10和S8基因分别转入pETl00／D．TOPO载体，构建了原核表达载体，并在BL21star(DE3)Ecoli中得到了高效表达，分别获得了约35kD的Pnsl0融合蛋白和70kD的P8融合蛋白。将获得的Pnsl0融

9、合蛋白免疫大耳白兔制备了抗血清，间接ELISA法测定抗血清效价为1：7680，效价高，Westernblot鉴定表明抗血清特异性强。表达产物及多克隆抗体的获得为下阶段深入研究提供了实验材料。关键词：RRSV；SlO片段；S8片段：序列分析；原核表达：抗血清福建农林大学硕士学位论文ABSTRACTRiceraggedstuntvirus(RRSV)isthetypememberoftheoryzavirusgroupofthefamilyReoviridae．RRSVcausesaseverediseaseinricewhichOccursinSoutheastern，Easte

10、rnandSouthernAsia．ThegenomeofRRSVcomprises10segmentsofdouble—strandedRNA(dsRNA)，andherewestudycloningandexpressionofgenomeSegment8(s8)andSegmentIO(SIO)andantiserumpreparationofPnsl0fusionprotein。111edsRNAwasextractedandpurifiedfromRRSVinfectedricet