猪链球菌2型EF与MRP基因串联表达及间接ELISA诊断方法的初步建立

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1、分类号S昼5§：三UDC硕士学位论文猪链球菌2型EF与MRP基因串联表达及间接ELISA诊断方法的初步建立付建论文答辩日期2Q!Q!Q鱼!鳢学位授予日期2Q!Q!Q鱼广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：‘彳透山洚7其f日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使

2、用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：l目即时发布口解密后发布(保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作者签名：彳无乏导师签名：专‘善’宅舫．7月／日2广西大学明页士善睨止论文搠n毫球菌2型EF--7MRP基因串联罩巳j鑫召J匐接ELISA诊昕方法的初步胃臼乞猪链球菌2型EF与MRP基因串联表达及间接

3、ELISA诊断方法的初步建立摘要猪链球菌2型是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原，是一种重要的人畜共患致病菌。本研究根据猪链球菌2型毒力因子EF和MI心的已知序列设计引物，通过PCR扩增出EF和MRP的基因片段，然后将扩增产物分别克隆入pMDl8一T载体中，构建了重组质粒pMDl8一T—EF和pMDl8一T—MRP。然后通过亚克隆方法分别从重组质粒plVlDl8一T—EF和pMDl8．T-MRP中扩增出包含EF蛋白和MRP蛋白主要抗原位点编码区(EF：2236—2397bp，MI冲：1026-1181bp)的目的片段。接着，利用重组PCR技术将上述含有EF和MRP主要抗原位点的基因

4、片段(2236bp一2397bp)和(1026bp一1181bp)用linker连结起来构成了一个含363bp重组片段。将该重组片段定向克隆到原核表达载体pET-32a中，构建了pET一32a-EF—MRP的表达载体；经过测序正确后，将重组表达质粒转入E．coliBL21(DE3)qb；用lmmol／LIPTG诱导后pET-32a-EF—MRP出现32．5KD大小的目的融合蛋白，蛋白主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。经Western．blotting鉴定表明，融合蛋白能够被猪链球菌2型阳性血清所识别。用Ni2+亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，获得3．58mg／L的H

5、is．EF—MRP目的蛋白。利用纯化的重组蛋白His．EF．MRP作为包被抗原，建立了检测猹筵蔓菌2型抗钵韵闻接EI。ISA方法，并且对间接ELISA方法反应参数和反应条件进行摸索。结果表明重组蛋白抗‘．—’‘—·’广西大葺明炙士．学位簧譬≮拥r孳莲球菌2型EF-7姗巾

6、l因串联习巳j亳刀U匐接ELISA诊昕方法的初步爿。屯原的最适包被浓度为O．5舭；最适包被条件是37℃过夜，以1％BSA作为封闭液；二抗HRP．羊抗猪IgG最佳工作浓度为1：2000；高免血清最大稀释度为1：400；待检血清的最佳稀释度为1：40；底物最适作用时间为37℃作用15min；阴阳性临界值为0．36。特异性

7、试验表明，建立的一／间接ELISA方法不均与其他细菌和病毒的阳性血清发生交叉反应。敏感_、、-_—--性试验表明，间接ELISA方法比AGID检测敏感32—128倍。稳定性实验‘、～、--_一表明，血清的批内变异系数为O．11％一5．92％，批间变异系数为4．15％一8．17％，建立的间接ELISA方法具有很高的重复性。研究结果表明建立的间接ELISA方法可以用于猪链球萤2型血清抗体的检测。关键词：猪链球菌2型重组蛋白EF—MRP原核表达间接ELISAⅡ广西大曹明曩士dq立论文#rlilE球Nl"2型EF与MRP基因串联表达召J匐接ELISA诊膏匕亨法的初步爿臼乞FUSIONEXPE

8、RSSIONOFEXTRACELLULARPROTEINAND圣—n丁RAⅦDASE—RELEASEDFACTOROF．SZRE刀DCDCC嬲S娜TYPE2ANDESTABLISHA伍NTOFD旧ERECTELISAABSTRACTStreptococcussuistype2(SS2)isaworldwidespreadandimportantzoonoticpathogen，whichcancausemanyseriousdiseasesinswinea