葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

《葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、园艺学报，2016，43(3)：538–548.ActaHorticulturaeSinica538doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0946；http：//www.ahs.ac.cn葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用*周俊，范旭东，董雅凤，张尊平，胡国君，任芳，李正男（中国农业科学院果树研究所，国家落叶果树脱毒中心，辽宁兴城125100）摘要：根据葡萄扇叶病毒（Grapevinefanleafvirus，GFLV）RNA2序列设计4对特异性引物

2、，通过引物筛选、体系优化，建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，扩增效率为100%，相关性系数为0.998，灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%，显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量，并检测58个

3、葡萄样品，结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大，最高含量是最低含量的81245.5倍，与ELISA和巢式RT-PCR相比，实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。关键词：葡萄；葡萄扇叶病毒；实时荧光定量RT-PCR；病毒浓度中图分类号：S663.1文献标志码：A文章编号：0513-353X（2016）03-0538-11DevelopmentandApplicationofaQuantitativeRT-PCRApproachforQuantificationofGrapevinefanle

4、afvirus*ZHOUJun，FANXu-dong，DONGYa-feng，ZHANGZun-ping，HUGuo-jun，RENFang，andLIZheng-nan（NationalCenterforEliminatingVirusesfromDeciduousFruitTree，ResearchInstituteofPomology，ChineseAcademyofAgricultureSciences，Xingcheng，Liaoning125100，China）Abstract：Toesta

5、blishhighsensitivityandrelativequantitativemethodofGrapevinefanleafvirus（GFLV），theSYBRGreenRT-PCRrealtimefluorescencequantitativemethodofFL-HPforGFLVwasestablishedbyusingprimerscreenandsystemoptimization.Theresultsshowedthatagoodlinear2correlation（R=0.99

6、8）obtainedfromstandardcurveofcDNA，andtheamplificationefficiencywas100%.Sensitivityofreal-timequantitativeRT-PCRmethodwasatleast100timeshigherthanthatwithconventionalRT-PCRand10timeshigherthanthatwithnestedRT-PCR，respectively.Three-timerepeatsrevealedthat

7、thecoefficientsofvariationbetweentheintra-andinter-assaywerebothwithin2.59%，indicatingareproducibilitydetectionmethodtoGFLV.ThestabilitytestresultsshowedthatEF1αandGAPDHgeneofgrapehashighstability.Real-timeRT-PCRmethodwasusedtodeterminethecontentof收稿日期：2

8、015–12–24；修回日期：2016–02–13基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-30-bc-3）*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：yfdong1234@163.com）周俊，范旭东，董雅凤，张尊平，胡国君，任芳，李正男.葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用.园艺学报，2016，43(3)：538–548.539GFLVin12differentgrap